小麦淀粉和贮藏蛋白突变体的鉴定及机制分析

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小麦品质受到遗传背景、栽培措施和生态条件的共同影响。淀粉和贮藏蛋白是小麦籽粒中的重要组成部分,其组分与含量影响小麦品质的形成。直链淀粉/支链淀粉比例直接影响面粉的加工品质和营养品质,而面筋是小麦面团的主要成分,决定面粉的加工品质。因此,创制具有不同淀粉、贮藏蛋白含量与组成的小麦新种质,可满足不同的加工需求。本研究利用前期创制的小麦EMS突变体库,从中成功鉴定到1份低直链淀粉突变体和1份高面筋含量突变体,为小麦品质改良提供了新种质。主要结果如下:1.本研究利用琼脂糖淀粉电泳的方法对2550份M3代EMS突变体直链淀粉进行检测,鉴定到1份直链淀粉含量降低突变体,利用SDS-PAGE验证发现该突变为Wx-A1蛋白缺失,并命名为M3-627。基因克隆结果表明,M3-627的Wx-A1基因在第十一外显子距起始密码子2681bp处存在一个由G到A的单碱基突变(G2681A),该突变将密码子TGG变为TGA,导致Wx-A1蛋白缺失。基于突变体单碱基突变位点,设计了特异性KASP分子标记,可用于后代基因分型。2.淀粉测定结果表明,突变体的直链淀粉、总淀粉和抗性淀粉含量显著降低。淀粉消化特性结果表明突变体在3种淀粉类型(天然淀粉、糊化淀粉、老化淀粉)中的快消化淀粉含量显著增加,仅在糊化淀粉和老化淀粉中观察到抗性淀粉的显著降低。SEM扫描电镜结果表明突变体与野生型的淀粉颗粒形态无明显差异,但颗粒表面有轻微凹陷,利用Image J分析发现突变体中5μm-10μm的颗粒数量明显降低。采用尿素模拟糊化结合DSC两种方法进行淀粉理化特性分析,结果表明由于Wx-A1基因缺失,降低直链淀粉含量,最终降低淀粉糊化温度。3.通过籽粒形态观察,获得1份籽粒胚乳部分轻微褶皱材料,并命名为Mut-236。通过对发育中种子生长的观察发现,Mut-236籽粒胚乳在开花后12天观察到轻微褶皱,随着籽粒发育,褶皱程度逐渐增加。蛋白组分测定结果表明,Mut-236的醇溶蛋白和总蛋白含量显著增加。A-PAGE、SDS-PAGE和RP-HPLC结果表明突变体的HMW-GS、LMW-GS亚基组成与野生型完全一致,而醇溶蛋白在ω、γ亚基区域存在明显差异。SEHPLC结果表明可溶性麦谷蛋白聚合体(EPP%)显著提高,但是不溶性麦谷蛋白聚合体含量(UPP%)显著降低。胚乳横切面SEM扫描电镜观察发现Mut-236淀粉颗粒被较多的蛋白质基质包埋,这可能与蛋白质含量增加有关。4.测定了2个生态点的加工品质参数,结果表明在温江生态点下,突变体Mut-236的湿面筋和干面筋含量分别为40.89±0.66%和12.705±0.17%显著高于野生型SM126的29.02±0.27%和9.22±0.23%,然而Mut-236的面筋指数为25.98±0.16显著低于野生型SM126的47.36±0.42。在康定生态点下,突变体Mut-236的湿面筋和干面筋含量分别为43.14±0.05%和14.80±0.41%显著高于野生型SM126的28.50±0.13%和9.82±0.04%,但是突变体Mut-236的面筋指数为47.94±0.95显著低于野生型SM126的86.25±0.63。除此之外,SDS-沉降值测定结果显示,在不同生态点下突变体均显著高于野生型。2个生态点下的加工品质参数变化趋势一致。5.选取发育中的种子用于RNA-Seq和Lable-free无标签蛋白定量分析(Label-free quantification,LFQ)。RNA-Seq共鉴定到754个DEGs,包括325个表达上调基因和429个表达下调基因,其中648个DEGs被功能注释;LFQ共鉴定125个DEPs,包括78个上调蛋白,47个下调蛋白,其中104个DEPs被功能注释。RNA-Seq和q RT-PCR基因验证发现部分醇溶蛋白基因、LMW-GS基因、NAM-B1基因和Avenin-like基因的表达显著上调以及蔗糖合酶基因显著下调。差异蛋白定量分析表明Avenin-like b5蛋白和α/β-醇溶蛋白的显著上调。除此之外,在核糖体、氨基酸生物合成、蛋白质加工与RNA转运和脂肪酸生物合成功能下鉴定到的DEPs以上调为主,而蔗糖磷酸酶和半胱氨酸内肽酶蛋白显著下调。RNA-Seq的GO富集分析表明,在分子功能(MF)类别中上调的基因分别在营养库活性、水解酶活性、叶绿素结合和ATP酶活性上显著富集;下调的基因在酶抑制剂活性、天冬氨酸内肽酶活性、半胱氨酸型内肽酶活性和天冬氨酸酯酶活性方面显著富集。RNA-Seq的KEGG富集统计结果表明,内质网中蛋白质加工、碳代谢、淀粉蔗糖代谢和光合作用途径下的DEGs数量占比相对较高。LFQ的GO富集结果表明,营养库活性占比例最大,其中包括α/β-醇溶蛋白和Avenin-like b5蛋白,这与突变体面筋含量增加的表型相符。其他DEPs分别在天冬酰胺-t RNA连接酶活性、碳水化合物代谢过程和细胞对硫饥饿的功能中显著富集,这些DEPs也是影响小麦品质可能的因素。LFQ的KEGG富集统计结果表明,核糖体、谷胱甘肽代谢、光合生物中的碳固定、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢以及氨基酸的生物合成途径下的DEPs数量占比相对较高。6.多组学分析表明突变体Mut-236的面筋差异不仅由转录水平调控,还会受到转录后或者翻译水平调控。基于表型和组学数据结果推测潜在的调控网络如下:NAM-B1基因的上调促进籽粒灌浆时营养物质向籽粒转移,导致蛋白质含量升高;氨基酸生物合成和核糖体功能相关的DEPs显著上调,影响下游内质网与高尔基体中蛋白体的形成;半胱氨酸内肽酶相关的基因和蛋白显著下调,减弱了醇溶蛋白的分解,导致醇溶蛋白含量增加;醇溶蛋白在转录和翻译水平上均显著上调,直接导致湿面筋含量增加同时降低面筋指数;Avenin-like的基因和蛋白显著上调,这可能会导致更多Avenin-like蛋白整合到面筋聚合体中,进而影响面筋的黏弹性;蔗糖合酶与蔗糖转移酶抑制剂基因显著下调以及蔗糖磷酸酶蛋白显著上调,促进蔗糖合成降低蔗糖分解,最终导致蔗糖的积累刺激储藏蛋白的合成。
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