利用微生物消除环境中的抗生素残留是当前的研究热点之一,但目前的研究多侧重于降解菌的筛选及其对抗生素的降解性能,较少关注降解菌对抗生素的降解机制及其环境应用时可能造成的耐药基因污染。因此本文以强力霉素高效降解菌苍白杆菌为研究对象,解析其对强力霉素的酶解方式,探讨降解酶代替降解菌的优势。从而为环境中兽用抗生素的去除措施提供参考以及为兽用抗生素降解酶的环境应用提供理论依据。提取强力霉素降解菌苍白杆菌的胞内酶、胞外酶及全酶等粗提酶,将其分别37℃、140 r/min振荡反应2d,确定不同来源酶对强力霉素的酶解效果;提取苍白杆菌中钝化酶类耐药基因tetX,与表达载体pET-28a+连接后转入感受态细胞E.coli DH5α及E.coli BL21(DE3)中。表达目的基因tetX将其纯化,并验证其蛋白分子量;将苍白杆菌以及上述试验得到的苍白杆菌胞内酶和重组菌胞内酶分别加入到含有10 mg/L强力霉素的PBS溶液中,37℃、140 r/min振荡反应10d,检测反应体系中的耐药基因含量,确定并比较它们对强力霉素的酶解效果;对苍白杆菌胞内酶及重组菌胞内酶分别进行硫酸铵分级沉淀,其饱和度区间为10%~30%、30%~50%和50%~80%,提取出对应分级酶后进行强力霉素的酶促降解试验;根据降解效果细化分级,提取0%~30%、30%~35%、35%~40%、40%~45%、45%~50%、50%~55%、55%~60%、60%~70%、70%~80%饱和度硫酸铵分级沉淀下的苍白杆菌胞内酶和重组菌胞内酶,通过强力霉素降解试验确定降解酶所在的最佳硫酸铵饱和浓度区间。本文所得主要结果如下:(1)苍白杆菌全酶粗提酶、胞内酶粗提酶、胞外酶粗提酶2d内对10mg/L的强力霉素的降解率分别为77.21±0.93%、66.62±1.27%、51.62±3.72%,其中全酶粗提酶的降解率显著高于胞内酶和胞外酶粗提酶(P<0.05),胞内酶粗提酶的降解率显著高于胞外酶粗提酶(P<0.05),胞内酶粗提酶约占其酶促降解性能的86.28%。(2)提取并表达苍白杆菌中钝化酶类耐药基因tetX,可获得能够有效降解强力霉素的重组菌胞内酶,10d内对10mg/L的强力霉素的酶解率为88.47±1.51%。(3)重组菌胞内酶、苍白杆菌胞内酶及苍白杆菌的培养基组10d内对10mg/L的强力霉素的降解率分别为88.47±1.51%、84.95±1.04%和88.91±1.04%。其中试验组的降解率均显著高于空白组(P<0.05);重组菌胞内酶组与苍白杆菌的培养基组对强力霉素的降解率无显著差异(P>0.05);苍白杆菌胞内酶组的降解率显著低于二者(P<0.05);苍白杆菌的培养基组tetA及tetM基因的拷贝数显著高于其他两组(P<0.05)。而重组菌胞内酶组tetX基因的拷贝数显著高于其他两组(P<0.05)。(4)以45%~50%、50%~55%、55%~60%饱和度的硫酸铵分级沉淀苍白杆菌胞内酶粗提酶,所获分级酶5 d内对10mg/L强力霉素的酶解率分别为60.01±3.11%、59.72±1.01%、58.07±4.01%,均显著高于其它硫酸铵饱和度区间的分级酶组(P<0.05);以50%~55%、55%~60%饱和度的硫酸铵分级沉淀重组菌胞内酶,所获分级酶5d内对10mg/L强力霉素的酶解率分别为55.41±5.75%、59.31±4.52%,均显著高于其它硫酸铵饱和度区间的分级酶组(P<0.05)。综上所述,苍白杆菌对强力霉素的降解方式主要是酶促降解,降解酶主要来源于胞内酶,而且耐药基因tetX可能在其中起重要作用。相较于苍白杆菌降解环境中强力霉素的微生物修复手段,利用tetX重组菌的胞内酶可以有效降低耐药基因传播风险,为降解酶代替降解菌修复环境中强力霉素残留提供了理论依据。