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目的：
仁术敷脐方是治疗小儿腹泻的临床经验方，具有成药前景。本课题在前期研究基础上，筛选仁术脐膏的提取工艺，优化超临界CO2萃取工艺参数，建立仁术脐膏质量标准，完成中药新药（六类）的制备工艺及质量标准研究。并初步探讨了仁术脐膏在小鼠靶器官的分布。
方法：
1.仁术脐膏的提取工艺考察
①以药效成分保留率为指标，比较砂仁、苍术、肉桂、丁香四味组方饮片，分别经水蒸气蒸馏工艺、超临界CO2萃取工艺的提取效果。
②以小鼠番泻叶致泻为药效模型，比较仁术敷脐方超临界CO2萃取浸膏及其药渣的敷脐止泻药效;进一步比较超临界CO2萃取浸膏两类组分挥发油、脂肪油的止泻药效;续用GC-MS联用技术探讨脂肪油的组成;并对40％脂肪酸单体成分膏剂进行了敷脐止泻药效考察。
③以萃取浸膏得率和指标成分保留率为指标，分别考察萃取压力、萃取温度、解析压力等萃取工艺参数的影响。在上述参数确定的基础上，进一步考察物料粉碎粒度的影响。并以优化工艺参数开展了仁术敷脐方超临界CO2萃取工艺中试研究。
2.仁术脐膏的质量控制
①采用气相色谱法，建立了仁术脐膏中乙酸龙脑酯、苍术素、桂皮醛、丁香酚的含量测定方法，并开展了系统适用性研究。
②按照《中国药典》（2015版四部），对仁术脐膏成品进行卫生学检查的验证试验。
③采用GC-MS联用技术，初步建立仁术脐膏原料、半成品、成品中两类主组分特征图谱的色谱分析条件（包括直接测定的挥发油主组分特征图谱、脂肪酸甲酯化后的脂肪酸主组分特征图谱）。
3.仁术敷脐方小鼠靶器官分布的初步考察
分别以组方饮片的超临界萃取浸膏，制备40％脐膏敷脐给药，采用GC-MS联用技术，考察其中药效成分在在小鼠血浆、皮肤、小肠、大肠中的分布。
结果：
1.仁术脐膏的提取工艺考察
①砂仁药材中乙酸龙脑酯，采用水蒸气蒸馏工艺，其保留率为102.8％;采用超临界CO2萃取工艺，在25、30MPa的萃取压力下，其保留率分别为97.1％、92.7％。苍术药材中的苍术素，采用水蒸气蒸馏工艺，其保留率为66.3％;采用超临界CO2萃取工艺，在20、30MPa的萃取压力下，其保留率分别为103.7％、94.0％。肉桂药材中的桂皮醛，采用水蒸气蒸馏工艺，其保留率为43.3％;采用超临界CO2萃取工艺，在25、35MPa的萃取压力下，其保留率分别为72.8％、71.2％。丁香药材中的丁香酚，采用水蒸气蒸馏工艺，其保留率为99.6％;采用超临界CO2萃取工艺，在20、25MPa的萃取压力下，其保留率分别为95.5％、93.0％。实验结果表明，砂仁中乙酸龙脑酯、丁香中丁香酚，在两种提取工艺下均可基本保留;苍术中苍术素、肉桂中桂皮醛，超临界CO2萃取工艺的保留率高于水蒸气蒸馏工艺。
②在小鼠番泻叶致泻下，仁术敷脐方超临界萃取CO2萃取浸膏显示敷脐止泻药效，药渣未显示止泻药效，确定其敷脐止泻有效部位为超临界萃取CO2萃取浸膏;超临界CO2萃取浸膏两类组分挥发油、脂肪油均显示止泻药效，2.22％、4.44％、8.88％、17.76％脂肪油脐膏显示止泻药效，且具有量效趋势;续用GC-MS联用技术检测，其主要组分为油酸(15.28％)、亚油酸(12.76％)、棕榈酸(4.42％)、花生酸(0.04％);上述成分40％膏剂均显示止泻药效。
综上①②，从成分保留率与药效学综合考虑，确定仁术敷脐方的提取工艺为超临界CO2萃取工艺。
③优化仁术敷脐方的超临界CO2萃取工艺参数为：饮片粉碎过二号筛，萃取压力28MPa±2MPa，萃取温度45℃，解析Ⅰ、Ⅱ压力均为6MPa，解析Ⅰ、Ⅱ温度均为40℃，CO2流量为50±5kg/h，萃取时间为2h，合并收集解析Ⅰ、Ⅱ中萃取浸膏。
以上述参数开展小试验证试验，得膏率为5.18％～5.38％，乙酸龙脑酯保留率为84.9％～86.2％，苍术素保留率为90.1～93.6％，桂皮醛保留率为61.9～68.7％，丁香酚保留率为86.8～96.8％，综合保留率为83.0～85.6％。不同批次得膏率及萃取浸膏中各成分含量、保留率基本一致。
三批中试生产中，得膏率为4.86～5.12％，乙酸龙脑酯保留率为85.2～97.4％，苍术素保留率为85.3～86.2％，桂皮醛保留率为47.6～53.6％，丁香酚保留率为91.2～91.6％，综合保留率为79.7～85.0％。得膏率为小试验证试验得率的92％～97％，综合保留率为小试验证试验综合保留率的95％～101％。
结果：表明在本工艺参数下，仁术脐膏超临界CO2萃取工艺可行、流畅、稳定。
2.仁术脐膏的质量控制
①仁术脐膏含量测定方法学验证表明，乙酸龙脑酯在0.03246～0.8564μg·μL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=1)，平均加样回收率为101.5％，RSD值为1.96％;苍术素在0.02454～0.6131μg·μL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=0.99999);平均加样回收率为为99.7％，RSD值为1.89％;桂皮醛在0.05978～1.4946μg·μL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=0.99998)，平均加样回收率为99.7％，RSD值为1.18％;丁香酚在0.07940～1.9851μg·μL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=0.99997)，平均加样回收率为101.0％，RSD值为1.38％;阴性对照无干扰，精密度、重复性、稳定性良好。
②卫生学检查验证试验中，采用稀释法、中和剂法及薄膜过滤法联用，金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉微生物计数方法回收率在0.5～2之间;控制菌检查法验证试验符合药典标准;木制剂符合2015年版药典中“非无菌不含药材原粉的中药制剂的微生物限度标准”项下皮肤给药制剂的要求。
③在选定色谱分析条件下，GC-MS图谱信息丰富，直接测定的挥发油主组分图谱中检出乙酸龙脑酯、苍术素、桂皮醛、丁香酚、D-樟脑、(-)-龙脑、α-蒎烯、榄香醇、β-石竹烯、α-石竹烯、沉香螺醇、β-桉叶醇、莪术烯、花生四烯酸、香豆素、罗勒烯、(+)-香橙烯、α-依兰油烯、2-甲氧基肉桂醛、β-毕橙茄醇、α-毕橙茄醇、乙酸丁香酚酯等色谱峰;脂肪酸甲酯化后的脂肪酸主组分特征图谱检出棕榈酸、亚油酸、油酸、花生酸等色谱峰。各色谱峰分离良好。
3.仁术敷脐方在小鼠靶器官分布的初步考察
在血浆中检测到乙酸龙脑酯、丁香酚，在皮肤中检测到樟脑、龙脑、乙酸龙脑酯、β-桉叶醇、苍术素、肉桂醇、α-蒎烯、丁香酚、β-石竹烯，在小肠中检测到丁香酚，在大肠中检测到樟脑、龙脑、乙酸龙脑酯、肉桂醇、α-蒎烯、丁香酚，有助于开展本品后续局部药代动力学的研究。
结论：
试验确定仁术敷脐方的止泻有效部位为超临界CO2萃取浸膏。完成仁术敷脐方工艺CO2萃取工艺的优化研究，中试验证了其可行性，为后续成型工艺试验提供了基础。建立的仁术脐膏质量标准可控制其有效性与安全性。两类主组分GC-MS特征图谱的色谱分析条件为本品特征图谱的建立奠定基础。初步考察了仁术脐膏药效物质在靶器官的分布情况，有助于开展本品后续局部药代动力学的研究。
仁术敷脐方是治疗小儿腹泻的临床经验方，具有成药前景。本课题在前期研究基础上，筛选仁术脐膏的提取工艺，优化超临界CO2萃取工艺参数，建立仁术脐膏质量标准，完成中药新药（六类）的制备工艺及质量标准研究。并初步探讨了仁术脐膏在小鼠靶器官的分布。
方法：
1.仁术脐膏的提取工艺考察
①以药效成分保留率为指标，比较砂仁、苍术、肉桂、丁香四味组方饮片，分别经水蒸气蒸馏工艺、超临界CO2萃取工艺的提取效果。
②以小鼠番泻叶致泻为药效模型，比较仁术敷脐方超临界CO2萃取浸膏及其药渣的敷脐止泻药效;进一步比较超临界CO2萃取浸膏两类组分挥发油、脂肪油的止泻药效;续用GC-MS联用技术探讨脂肪油的组成;并对40％脂肪酸单体成分膏剂进行了敷脐止泻药效考察。
③以萃取浸膏得率和指标成分保留率为指标，分别考察萃取压力、萃取温度、解析压力等萃取工艺参数的影响。在上述参数确定的基础上，进一步考察物料粉碎粒度的影响。并以优化工艺参数开展了仁术敷脐方超临界CO2萃取工艺中试研究。
2.仁术脐膏的质量控制
①采用气相色谱法，建立了仁术脐膏中乙酸龙脑酯、苍术素、桂皮醛、丁香酚的含量测定方法，并开展了系统适用性研究。
②按照《中国药典》（2015版四部），对仁术脐膏成品进行卫生学检查的验证试验。
③采用GC-MS联用技术，初步建立仁术脐膏原料、半成品、成品中两类主组分特征图谱的色谱分析条件（包括直接测定的挥发油主组分特征图谱、脂肪酸甲酯化后的脂肪酸主组分特征图谱）。
3.仁术敷脐方小鼠靶器官分布的初步考察
分别以组方饮片的超临界萃取浸膏，制备40％脐膏敷脐给药，采用GC-MS联用技术，考察其中药效成分在在小鼠血浆、皮肤、小肠、大肠中的分布。
结果：
1.仁术脐膏的提取工艺考察
①砂仁药材中乙酸龙脑酯，采用水蒸气蒸馏工艺，其保留率为102.8％;采用超临界CO2萃取工艺，在25、30MPa的萃取压力下，其保留率分别为97.1％、92.7％。苍术药材中的苍术素，采用水蒸气蒸馏工艺，其保留率为66.3％;采用超临界CO2萃取工艺，在20、30MPa的萃取压力下，其保留率分别为103.7％、94.0％。肉桂药材中的桂皮醛，采用水蒸气蒸馏工艺，其保留率为43.3％;采用超临界CO2萃取工艺，在25、35MPa的萃取压力下，其保留率分别为72.8％、71.2％。丁香药材中的丁香酚，采用水蒸气蒸馏工艺，其保留率为99.6％;采用超临界CO2萃取工艺，在20、25MPa的萃取压力下，其保留率分别为95.5％、93.0％。实验结果表明，砂仁中乙酸龙脑酯、丁香中丁香酚，在两种提取工艺下均可基本保留;苍术中苍术素、肉桂中桂皮醛，超临界CO2萃取工艺的保留率高于水蒸气蒸馏工艺。
②在小鼠番泻叶致泻下，仁术敷脐方超临界萃取CO2萃取浸膏显示敷脐止泻药效，药渣未显示止泻药效，确定其敷脐止泻有效部位为超临界萃取CO2萃取浸膏;超临界CO2萃取浸膏两类组分挥发油、脂肪油均显示止泻药效，2.22％、4.44％、8.88％、17.76％脂肪油脐膏显示止泻药效，且具有量效趋势;续用GC-MS联用技术检测，其主要组分为油酸(15.28％)、亚油酸(12.76％)、棕榈酸(4.42％)、花生酸(0.04％);上述成分40％膏剂均显示止泻药效。
综上①②，从成分保留率与药效学综合考虑，确定仁术敷脐方的提取工艺为超临界CO2萃取工艺。
③优化仁术敷脐方的超临界CO2萃取工艺参数为：饮片粉碎过二号筛，萃取压力28MPa±2MPa，萃取温度45℃，解析Ⅰ、Ⅱ压力均为6MPa，解析Ⅰ、Ⅱ温度均为40℃，CO2流量为50±5kg/h，萃取时间为2h，合并收集解析Ⅰ、Ⅱ中萃取浸膏。
以上述参数开展小试验证试验，得膏率为5.18％～5.38％，乙酸龙脑酯保留率为84.9％～86.2％，苍术素保留率为90.1～93.6％，桂皮醛保留率为61.9～68.7％，丁香酚保留率为86.8～96.8％，综合保留率为83.0～85.6％。不同批次得膏率及萃取浸膏中各成分含量、保留率基本一致。
三批中试生产中，得膏率为4.86～5.12％，乙酸龙脑酯保留率为85.2～97.4％，苍术素保留率为85.3～86.2％，桂皮醛保留率为47.6～53.6％，丁香酚保留率为91.2～91.6％，综合保留率为79.7～85.0％。得膏率为小试验证试验得率的92％～97％，综合保留率为小试验证试验综合保留率的95％～101％。
结果：表明在本工艺参数下，仁术脐膏超临界CO2萃取工艺可行、流畅、稳定。
2.仁术脐膏的质量控制
①仁术脐膏含量测定方法学验证表明，乙酸龙脑酯在0.03246～0.8564μg·μL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=1)，平均加样回收率为101.5％，RSD值为1.96％;苍术素在0.02454～0.6131μg·μL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=0.99999);平均加样回收率为为99.7％，RSD值为1.89％;桂皮醛在0.05978～1.4946μg·μL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=0.99998)，平均加样回收率为99.7％，RSD值为1.18％;丁香酚在0.07940～1.9851μg·μL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=0.99997)，平均加样回收率为101.0％，RSD值为1.38％;阴性对照无干扰，精密度、重复性、稳定性良好。
②卫生学检查验证试验中，采用稀释法、中和剂法及薄膜过滤法联用，金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉微生物计数方法回收率在0.5～2之间;控制菌检查法验证试验符合药典标准;木制剂符合2015年版药典中“非无菌不含药材原粉的中药制剂的微生物限度标准”项下皮肤给药制剂的要求。
③在选定色谱分析条件下，GC-MS图谱信息丰富，直接测定的挥发油主组分图谱中检出乙酸龙脑酯、苍术素、桂皮醛、丁香酚、D-樟脑、(-)-龙脑、α-蒎烯、榄香醇、β-石竹烯、α-石竹烯、沉香螺醇、β-桉叶醇、莪术烯、花生四烯酸、香豆素、罗勒烯、(+)-香橙烯、α-依兰油烯、2-甲氧基肉桂醛、β-毕橙茄醇、α-毕橙茄醇、乙酸丁香酚酯等色谱峰;脂肪酸甲酯化后的脂肪酸主组分特征图谱检出棕榈酸、亚油酸、油酸、花生酸等色谱峰。各色谱峰分离良好。
3.仁术敷脐方在小鼠靶器官分布的初步考察
在血浆中检测到乙酸龙脑酯、丁香酚，在皮肤中检测到樟脑、龙脑、乙酸龙脑酯、β-桉叶醇、苍术素、肉桂醇、α-蒎烯、丁香酚、β-石竹烯，在小肠中检测到丁香酚，在大肠中检测到樟脑、龙脑、乙酸龙脑酯、肉桂醇、α-蒎烯、丁香酚，有助于开展本品后续局部药代动力学的研究。
结论：
试验确定仁术敷脐方的止泻有效部位为超临界CO2萃取浸膏。完成仁术敷脐方工艺CO2萃取工艺的优化研究，中试验证了其可行性，为后续成型工艺试验提供了基础。建立的仁术脐膏质量标准可控制其有效性与安全性。两类主组分GC-MS特征图谱的色谱分析条件为本品特征图谱的建立奠定基础。初步考察了仁术脐膏药效物质在靶器官的分布情况，有助于开展本品后续局部药代动力学的研究。