类黄酮是在植物中普遍存在的一类天然次生代谢产物,对植物自身起着非常重要的作用。有研究发现,类黄酮具有抗癌、抗氧化、抗菌等功能,因此类黄酮对于人类具有重要的保健功能。同时,类黄酮类化合物能够明显增强植物的抗逆境胁迫能力。类黄酮在植物体内主要以结合态(黄酮糖苷)或自由态(黄酮苷元)形式存在。糖基转移酶是一类向受体添加糖基,催化糖和受体形成糖苷键的酶类,糖基化修饰调节了生物分子的活性、稳定性、水溶性等。水稻中的糖基转移酶成员众多,但多数成员的功能尚不清楚。本论文主要针对水稻中黄酮和花青素的糖基化修饰,鉴定相关的糖基转移酶基因,分析它们的功能作用,为水稻的营养品质改良和抗逆育种奠定理论基础。本论文的主要研究内容及结果如下:1、水稻黄酮糖基转移酶基因UGT40的鉴定和作用分析根据公开发表的基因芯片数据,我们选择了一批水稻糖基转移酶的候选基因,对它们进行了克隆、原核表达和蛋白纯化。通过生化分析发现,糖基转移酶基因UGT40的编码产物能够糖基化修饰黄酮类物质槲皮素、山萘酚、柚皮素等。为了进一步检测UGT40的功能作用,我们将该基因转入拟南芥,在模式植物中验证该基因的功能。首先,获得了 UGT40的过表达转基因植株。我们检测转基因拟南芥中黄酮的含量,发现UGT40过表达植株比野生型能积累更多的黄酮类化合物。同时,分析了转基因植物中黄酮合成相关基因(CHS、CHI、FLS1、F3H)的表达情况,发现拟南芥过表达植株中这些基因比野生型明显上调。可能是UGT40的转入影响了黄酮代谢途径,进而造成黄酮的积累。另外,对转基因拟南芥进行了耐逆特性分析。发现在干旱条件下与野生型相比,UGT40过表达的拟南芥在种子萌发率、子叶转绿情况、主根根长以及在土壤干旱条件下的生长情况,都表现出耐逆性增强。测定了转基因拟南芥在干旱条件下的一些耐逆生理指标。发现可溶性糖、脯氨酸含量要比野生型高,离体失水率与野生型相比明显较低。同时,进行了 NBT、Evans Blue染色,染色结果也进一步说明了UGT40过表达后清除活性氧(ROS)的能力增强,从而提高植物的耐逆性。最后检测了在干旱条件下,各转基因株系中植物耐逆相关基因的诱导表达情况,包括DREB2A、AIL1、COR47、CAT1等。发现在干旱处理条件下,UGT40过表达后植株中这些基因的表达量明显比野生型高。因此推测在干旱条件下,可能由于UGT40表达量上调,植物体内黄酮含量增多,一方面黄酮作为信号分子,激活耐逆相关基因表达量上调;另一方面黄酮作为ROS的清除剂,清除了过多的ROS,从而提高了植物的耐旱性。2、紫稻花青素相关糖基转移酶基因的克隆与底物鉴定根据普通水稻数据库中预测的花青素糖基转移酶基因序列,通过引物设计和PCR扩增,从紫稻中获得了一个糖基转移酶的同源基因,发现与普通水稻中同源基因相比,该基因发生了一个碱基的替换,命名为PUGT33。进一步地,获得了PUGT33的转基因拟南芥。发现PUGT33过表达植株与野生型相比,在下胚轴等部位表现出明显增加的花青素积累表型。检测转基因株系的花青素含量,发现转基因株系的花青素含量比野生型高。另外,也检测了花青素合成途径相关基因的表达量,包括CHS、F3H、DFR、ANS等基因。发现在转基因拟南芥中这些基因的表达量明显高于野生型。通过以上对酶活性和异源表达的研究结果,初步表明PUGT33可能是紫稻中负责花青素糖基化的糖基转移酶基因。该基因可能通过影响花青素代谢途径和相关基因表达,调控紫稻中的花青素合成。