【摘 要】
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目的MYH13的编码产物为肌球蛋白重链My HC-eo亚型,是构成肌球蛋白分子的重要亚基。课题组前期在一个无虹膜症家系中发现患者MYH13发生错义突变。以此为基础,本研究在细胞和动物水平探讨了MYH13突变与无虹膜症的相关性,还解析了该基因的生物学功能。方法使用共聚焦显微镜观察My HC-eo的细胞内定位;使用MTS法和流式细胞仪分别检测MYH13突变对于细胞增殖和凋亡的影响。使用q RT-PCR
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（课题编号:31571295）；
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目的MYH13的编码产物为肌球蛋白重链My HC-eo亚型,是构成肌球蛋白分子的重要亚基。课题组前期在一个无虹膜症家系中发现患者MYH13发生错义突变。以此为基础,本研究在细胞和动物水平探讨了MYH13突变与无虹膜症的相关性,还解析了该基因的生物学功能。方法使用共聚焦显微镜观察My HC-eo的细胞内定位;使用MTS法和流式细胞仪分别检测MYH13突变对于细胞增殖和凋亡的影响。使用q RT-PCR和Western blotting检测小鼠中Myh13的表达情况;利用CRISPR/Cas9技术构建Myh13Ser181Tyr敲入小鼠和Myh13敲除小鼠;使用苏木精和伊红（hematoxylin＆eosin,H＆E）染色和透射电子显微镜（transmission electron microscopy,TEM）观察眼球和眼外肌的变化;使用RNA-seq检测小鼠Myh13敲除前后眼外肌中的差异表达基因。结果My HC-eo定位于细胞胞浆,MYH13 p.Ser181Tyr突变对该蛋白胞内定位无明显影响,对细胞的增殖和凋亡也无明显作用。在野生型（wild type,WT）小鼠中,Myh13特异性高表达于眼外肌中。在Myh13Ser181Tyr敲入小鼠表型分析中,WT、Myh13wt/mt和Myh13mt/mt小鼠眼外肌中Myh13的表达水平无明显差异;Myh13wt/mt小鼠自交所得的子代基因型比例与孟德尔遗传规律相符;Myh13wt/mt和Myh13mt/mt小鼠未出现眼球异常的表型;H＆E染色提示小鼠眼外肌无明显病变;电镜下可见Myh13mt/mt小鼠的眼外肌中肌质网扩张。在Myh13敲除小鼠表型分析中,与WT小鼠相比,Myh13+/-小鼠眼外肌中Myh13的表达减少,Myh13-/-小鼠几乎不表达该基因;Myh13+/-小鼠自交所得的子代基因型比例与孟德尔遗传规律相符;Myh13+/-和Myh13-/-小鼠的体重和血生化指标无明显异常;仅少部分Myh13-/-小鼠出现瞳孔扩张、虹膜萎缩等眼部异常;H＆E染色中小鼠眼外肌无明显病变;电镜下,Myh13+/-小鼠眼外肌中可见脂滴,Myh13-/-小鼠眼外肌中同时可见脂滴和肌质网扩张。与WT小鼠相比,Myh13-/-小鼠眼外肌中31个基因表达下调,2个基因表达上调;经q RT-PCR验证,Myh13-/-小鼠眼外肌中中间丝相关基因Krt17、Krt14和Dsp表达下调。结论Myh13突变或敲除可导致小鼠眼外肌微观结构的异常;Myh13敲除可导致眼外肌中间丝相关基因的表达下调,可能对细胞骨架结构产生影响;MYH13突变与无虹膜症的发生可能并不直接相关,需进一步分析。
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