脊髓损伤（Spinal cord injury,SCI）是由椎骨骨折或脱位引起的脊髓或马尾神经损伤,是一种强破坏性、高致残性的神经损伤疾病,伴有不同程度的感觉和/或运动缺陷。目前SCI的临床治疗只能延缓损伤进程,减少继发性损伤,尽量挽救残留的神经元及神经组织,以保留轴突及神经功能。这些方法不能使离断的神经纤维重新形成连接,亟待有效的临床治疗方法。本文针对SCI后神经细胞缺失、抑制性微环境、神经营养因子缺失的问题,以干细胞组织工程为核心,围绕组织工程三要素,实现了种子细胞、生物支架和细胞生长因子的有机结合。本文利用甲基丙烯酸酐化明胶（GelMA）作为生物支架,同时负载转谷氨酰胺酶2转染的外胚层间充质干细胞（TG2-EMSCs）、丁香酸混合胶束（SA-TPGS-Ms）及神经再生因子组合,包括音猬因子（SHH）、神经营养素3（Neurotrophin-3,NT3）和神经生长因子（Nerve growth factor,NGF）,通过微挤压3D打印技术“一步法”打印,制备出脊髓仿生支架,并用于大鼠脊髓损伤修复研究。本文主要研究内容如下:1.天然小分子药物丁香酸神经保护及抗炎作用研究脊髓损伤后,再生抑制性物质如活性氧（Reactive oxygen species,ROS）及炎症因子大量聚集,抑制神经细胞的再生,故探寻具有神经保护及抗炎作用的天然小分子具有重要研究意义。本章通过H2O2诱导PC12细胞氧化应激损伤模型及脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导BV2小胶质细胞炎症损伤模型,评价了天然活性成分丁香酸（Syringic acid,SA）的神经保护作用及抗炎作用。结果表明,SA可显著提高细胞存活率,减少乳酸盐脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）泄漏,降低细胞内ROS水平。同时,SA可通过抑制Ca2+内流及线粒体膜电位下降,从而保护细胞膜的完整性。此外,SA可显著提高细胞抗氧化能力,降低脂质过氧化水平。SA对ROS的清除最终抑制了氧化应激引起的细胞凋亡。另一方面,SA可显著减少一氧化氮（NO）的生成,同时抑制白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、肿瘤生长因子-α（TNF-α）及前列腺素E2（PGE2）炎症因子的释放量。综上,丁香酸作为兼有神经保护及抗炎作用的天然小分子化合物,可用于SCI治疗研究。2.丁香酸缓释递药系统的构建及评价针对SA低溶解性及快速消除的问题,本章利用Pluronic聚合物F127、F68及TPGS构建SA-F127/F68/TPGS混合胶束递药系统,进行体外相关表征,研究其细胞摄取药物动力学,并验证了混合胶束的神经保护及抗炎作用。结果表明,F127/F68/TPGS混合胶束包封率为94.39±0.24%,载药量为4.42±0.29%,可在较低的临界胶束浓度值（0.00198 mg/m L）下,自组装形成混合胶束。混合胶束纳米颗粒呈球形,粒径小（21.18±0.44 nm）,粒径分布均一（PDI=0.134±0.002）。混合胶束稀释稳定性及p H稳定性好,储存45天未见明显粒径及包封率变化。体外释放结果表明,混合胶束显著缓释了SA,为non-Fickian扩散过程。荧光显微镜定性研究发现,F127/F68/TPGS混合胶束体系可显著提高被包载药物的细胞摄取量。以UPLC-MS/MS法构建了细胞生物样品SA含量的测定方法,方法学验证表明,该法专属性强、线性良好（10-2000 ng/m L,r~2＞0.999）、精密度及准确性高（RSD＜5%）,适用于细胞样品中低浓度SA的快速、准确定量分析。利用Michaelis-Menten函数拟合细胞摄取数据以研究药物浓度对细胞摄取的影响,混合胶束提高了动力学参数Km值及最大摄取速率Vmax值。摄取过程呈现明显的温度依耐性,内吞抑制剂及外排蛋白抑制剂实验结果表明,内吞过程主要是由笼形蛋白介导。细胞摄取动力学研究表明,混合胶束摄取显著提高了药物摄取速率（71.355±6.460 vs.48.027±7.978 ng/h）,减缓了药物消除速率(0.299±0.053 vs.0.364±0.106 h-1)。体外药效学研究表明,相比于原料药,混合胶束可显著提高氧化应激损伤后的细胞存活率,减少LDH释放量,降低胞内ROS水平。混合胶束还可抑制炎症损伤后的NO及TNF-α的释放量,显示出优异的神经保护作用。综上,具有缓释作用的F127/F68/TPGS混合胶束可作为神经保护的药物NDDS。3.EMSCs自交联蛋白长效释放系统的构建及评价本章基于外胚层间充质干细胞（EMSCs）,构建转谷氨酰胺酶2蛋白（TG2）长效释放系统,对TG2-EMSCs的细胞生物学特性及细胞移植安全性进行研究。使用腺病毒载体（pYr-ad Shuttle-8）包载TG2基因,通过Adenovirus Expression Clone包装,构建Ad-TG2-GFP重组腺病毒。琼脂糖凝胶电泳鉴定及BLAST程序序列比分析表明,基因序列与目的基因序列一致,Ad-TG2-GFP重组腺病毒构建成功。Ad-TG2-GFP滴度为3.435×10~9 PFU/m L。以GFP表达强度及TG2蛋白表达量为评价标准,筛选出最适感染复数（MOI）为125,转染时间为12 h。Ad-TG2-GFP转染EMSCs后可在两周内稳定高表达TG2蛋白,实现了TG2的长效释放。Ed U结果表明,转染Ad-TG2-GFP腺病毒不影响EMSCs细胞的增殖。划痕实验结果表明,TG2-EMSCs细胞的迁移能力强于空白EMSCs细胞。Annexin V PE/7-AAD凋亡流式及Western Blotting检测凋亡相关蛋白（Caspase-3、Caspase-9、Bax及Bcl-2）结果表明,Ad-TG2-GFP腺病毒不影响细胞凋亡过程。TG2-EMSC的干细胞标志物CD133、SOX1、Vimentin、Nestin、Snail高表达,表明转染后的细胞维持有干性。静脉注射及皮下注射移植细胞,对裸鼠8周的毒性反应、致瘤性及成瘤性进行研究。结果表明TG2-EMSCs不具有皮下成瘤性,静脉移植不具有致瘤性,心功能（BNP）、肝功能（ALT、AST、ALP、GGT、TBA及TBIL）、肾功能（UA、Cr、BUN及LDH）指标与正常裸鼠相比无差异,HE染色无明显病变,表明TG2-EMSCs具有良好的移植安全性,可作为种子细胞用于SCI体内研究。4.3D打印GelMA水凝胶的制备及表征本章使用3D喷墨打印技术筛选了EMSCs细胞与神经再生蛋白因子的组合,使用3D微挤压生物打印机制备了仿生脊髓GelMA水凝胶支架,并进行物理学及生物相容性表征研究。Ed U及细胞迁移结果表明,组合因子（SHH+NT3+NGF）可促进EMSCs的细胞增殖及迁移。免疫荧光结果显示,MAP2、NF200、Tuj1、Tau及Synapsin均为阳性,表明组合因子可有效诱导EMSCs细胞转分化为神经元。SHH+NT3+NGF可作为SCI修复的神经营养因子蛋白,添加至水凝胶复合支架系统中。NMR及FT-IR表征结果表明,实验成功制备了GelMA聚合物,反应得率为75.5%。GelMA聚合物经紫外交联固化反应,形成水凝胶,具有合适的机械性能。GelMA水凝胶的G’为266 Pa,损耗因子为0.0929±0.0119,粘度为264.727±10.295 Pa.s。SEM结果表明,GelMA水凝胶具有多孔结构,孔洞相互贯通,孔径约为60～80μm。溶胀性能结果表明,GelMA水凝胶含水率为87.69±0.06%,溶胀率为5.59±0.11 g/g,孔隙率为39.22±2.32%,水凝胶具有大量孔隙结构,有利于营养物质的扩散,可模拟ECM,便于细胞的生长及分化。显微镜观察表明,EMSCs细胞在GelMA水凝胶中可充分伸展,贴附伸展,细胞状态良好。CCK-8、死活染、Ed U试验及鬼笔环肽染色结果表明,GelMA水凝胶对EMSCs细胞毒性小,不影响增殖能力,肌动蛋白表达与正常细胞无异,显示出良好的生物相容性。划痕试验结果表明,GelMA水凝胶不影响细胞迁移能力。此外,CD133及Vimentin免疫荧光染色结果表明,EMSCs细胞在GelMA水凝胶中依然保持干性。综上,GelMA水凝胶可作为SCI修复的生物支架。5.3D打印仿生脊髓复合支架用于大鼠SCI修复研究本章以GelMA作为生物支架材料,同时负载TG2-EMSCs种子细胞、SA-TPGS-Ms混合胶束及神经再生因子（SHH+NT3+NGF）,通过微挤压3D打印技术构建3D仿生脊髓GelMA水凝胶,研究其对大鼠SCI的体内修复效果。结果表明,相比于单独使用支架和种子细胞,移植3D仿生脊髓GelMA水凝胶可明显改善SCI大鼠行为学及运动功能,提高BBB评分,8周最终评分达到11.5±1.87分。旷场试验结果表明,SCI大鼠运动轨迹明显增加并复杂化,且纵向运动增多。后肢拍照及足迹分析表明,SCI大鼠后肢支撑功能有明显恢复,可在短距离内连续步态行走,有前后肢较为协调的运动,可见后爪的精细动作。病理学检测结果表明,3D仿生脊髓GelMA水凝胶可填充SCI形成的空腔,显著恢复SCI大鼠脊髓组织的完整性,减少胶质瘢痕空洞,改善脊髓神经纤维排列。Luxol Fast Blue染色结果表明,脊髓损伤区域以及尾侧均可见大量紫色的神经元。BDA顺行示踪结果表明,3D仿生脊髓GelMA水凝胶能够在损伤处起到“桥梁”的作用,连接上下行神经纤维。免疫荧光染色结果表明,3D仿生脊髓GelMA水凝胶可显著减少GFAP表达,抑制星形胶质细胞的反应性增生,减少胶质瘢痕增生。在损伤中心存在大量穿过胶质瘢痕的NF200强阳性表达区域,表明神经细胞成功穿过了胶质瘢痕,重新形成了连接。此外,Tuj1阳性区域不仅存在于水凝胶移植区域,在截断的上下端均可观察到。Tuj1阳性区域穿过了胶质瘢痕区域,在损伤的上下端重新形成了连接,表明3D仿生脊髓GelMA水凝胶可明显促进神经元细胞的再生。综上,3D仿生脊髓GelMA水凝胶具有良好的SCI修复效果,为脊髓损伤的治疗提供了新技术、新思路。