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结直肠癌是人类常见的恶性肿瘤之一，其总体的5年生存率在50-70%。淋巴结及血管转移是结直肠癌的一个重要的生物学特征，也是预后较差的指标，结直肠癌患者中约1/3的患者在确诊时已出现远处转移。手术治疗仍然是早中期结直肠癌治疗的主要手段，以放、化疗为基础的靶向治疗在中晚期结直肠癌的治疗中发挥越来越重要的作用。VEGF和EGFR为靶点的生物靶向治疗在结直肠癌临床治疗中得到了普遍应用，但其原发或继发性耐药是困扰其临床疗效的主要障碍之一。酪氨酸激酶受体c-Met是一类在结直肠癌中呈高表达，且与肿瘤浸润和淋巴结、肝转移有关的分子，肝细胞生长因子（HGF）是其配体，HGF/c-Met信号通路激活后可以促进肿瘤细胞增殖、侵袭和转移，促进肿瘤组织周围血管形成，研究表明肝细胞生长因子（HGF）及其配体c-Met在结直肠癌组织中的表达量明显高于正常的结直肠黏膜。c-Met很有可能成为结直肠癌治疗的新生物靶点，针对c-Met的靶向治疗联合传统放、化疗对结直肠癌的治疗带来益处。在前期实验中我们发现肝细胞生长因子（HGF）可以促进SW620结肠癌细胞增殖和迁移，本实验采用多西环素（Doxycycline）可调控诱导小分子干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）方法抑制酪氨酸激酶受体c-Met基因的表达，探讨适当沉默c-Met后对人结肠癌细胞SW620的增殖，及对SW620细胞凋亡的影响。目的：以人c-Met基因为靶基因，设计以其为靶向的可调控siRNA，并构建携带此siRNA的重组质粒，进行慢病毒包装，筛选出稳定表达siRNA的细胞系，并探讨适当敲除c-Met后对SW620细胞增殖、凋亡的影响。方法：1.设计3条针对c-Met基因不同位点的siRNA片段，将其克隆到TA载体上，利用Megatran1.0介导将克隆的TA载体瞬时转染进SW620细胞内，用Western Blot，RT-PCR方法挑选出沉默效率最好的siRNA。同时设定scramble和SW620为阴性对照组和空白对照组。2.把沉默效率最好的siRNA克隆到pSD400慢病毒载体中，利用Megatran1.0介导，将pMDL，pRSV，pMDG等辅助质粒及连有目的片段的pSD400-c-Met-shRNA共转染293T细胞进行病毒包装，收集病毒液并感染SW620细胞，利用嘌呤霉素（puromycin）筛选出稳定表达针对c-met的shRNA的细胞系。3.利用多西环素（Doxycycline）诱导稳定细胞系，用Western BlotRT-PCR方法，在RNA水平和蛋白水平检测稳定细胞系c-Met的表达量，及敲低c-met后对稳定细胞系增殖的影响。结果：1.TA载体构建成功，通过酶切及测序验证重组质粒的正确性，瞬时转染后Realtime-PCR结果显示TA-c-Met-shRNA1质粒使30%的c-Met基因得以表达，同样瞬时转染后western blot结果显示TA-c-Met-shRNA1（shRNA1）使40%的c-Met基因得以表达，比TA-c-Met-shRNA（2shRNA2）（63%、64%）、TA-c-Met-shRNA3（shRNA3）（54%、88%）效果明显。shRNA-c-met1基因敲除效果最好。2.成功构建pSD400-c-Met-shRNA质粒，慢病毒包装、病毒感染SW620细胞24h后经嘌呤霉素筛选一周后有单克隆产生，扩大培养。3.用不同浓度（0、1、10、100、500、1000ng/ml）多西环素（DOX）诱导pSD400-c-Met-shRNA-SW620，经Western-blot、RT-PCR检测稳定细胞系c-Met表达量随着DOX浓度的增加呈逐渐下降的趋势。稳定细胞株构建成功。4.pSD400-c-Met-shRNA-SW620细胞株加入多西环素诱导后由于c-Met基因被适当敲除在第三天出现了细胞增殖的抑制，与不加多西环素组有明显的统计学差异（P<0.05），而pSD400-scramble-SW620、SW620无论加与不加多西环素诱导，细胞增殖无明显差异（P>0.05）。适当敲除SW620细胞c-Met基因后细胞的增殖明显低于对照组。结论：1.不同位点的siRNA，对结肠癌SW620细胞c-Met的沉默效率不同。2.能够构建可调控表达针对c-Met基因siRNA的慢病毒载体，并能成功得到稳定的细胞系。3.适当敲除SW620细胞的c-Met基因能够显著抑制细胞的增殖。