心脏病的发生受多种基因的复杂调控,研究心脏发育相关的调控基因是了解心脏病发生机制的突破口,也是对该类疾病进行防治的重要手段。基因敲除和敲入是研究基因功能的常用工具,近几年出现的基因编辑技术CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)系统已在各种模式动物的基因敲除研究中得到广泛应用。斑马鱼作为模式动物在遗传学和分子生物学等研究领域具有其独特的特点,目前本实验室已拥有完善的斑马鱼模式生物研究平台。Tcap基因是本实验室已初步鉴定的人类心脏发育候选基因,目前国际上尚无该基因的突变品系建立及相关作用机制的报道。为探究该基因在心脏发育方面的生物学功能,本文主要利用CRISPR/Cas9基因敲除技术构建斑马鱼基因突变品系。首先,我们通过相应网站分析Tcap基因功能结构域,在该基因的一号外显子区域设计了特异性较好的g RNA。然后将g RNA进行体外转录合成,将合成好的g RNA与h Cas9共注射到斑马鱼胚胎的一细中,待培养至48h后收集胚胎进行基因组的PCR扩增,送测序鉴定g RNA的有效性,将具有有效性的剩余胚胎培养至三个月月龄后分别进行剪尾鉴定,测序结果表明其中5条F0代个体出现双峰。将这5条鱼的TA克隆序列与斑马鱼野生型WT序列进行比对后发现有碱基缺失。为了深入研究Tcap基因调控心脏发育的作用机制,我们将斑马鱼Tcap基因的CDS序列克隆至p Tol2-CMLC2-IRES-EGFP载体构建斑马鱼Tcap基因过表达质粒,然后将该过表达质粒与体外合成的Tol2转座酶共注射至斑马鱼的早期胚胎中,构建斑马鱼Tcap基因的过表达品系,以研究斑马鱼早期胚胎中Tcap基因表达量的提高对斑马鱼心脏发育的影响,探索Tcap基因在调控心脏发育中的作用。相关研究工作正在进行中。本文还利用CRISPR/Cas9基因敲除技术构建斑马鱼基因CXXC5A和CXXC5B基因的敲除品系,相关研究工作正在进行中。本文的研究将为后续在胚胎整体水平深入研究Tcap、CXXC5A和CXXC5B基因的分子生物学功能奠定基础,并为临床治疗提供新的研究方向。