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苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis,简称Bt)是当前世界上应用最为广泛的微生物杀虫剂,其杀虫活性主要来源于伴胞晶体。有研究表明,苏云金芽胞杆菌Cry1类原毒素C端区域对于Bt杀虫晶体的形成具有重要作用,研究原毒素C端区域的功能,对提高杀虫晶体蛋白的产量,增强Bt杀虫晶体蛋白的溶解性及杀虫毒力具有重要意义。有研究表明,在昆虫中肠道的碱性环境中,Cry1Ac菱形晶体的溶解能力明显高于Cry2Aa方形晶体。为了增强Cry2Aa原毒素的溶解能力,本研究利用Cry2Aa原毒素的N-端与Cry1Ac的C-端区域构建了融合蛋白,分析融合蛋白的表达情况及杀虫毒力。从Bt4.0718高毒力菌株中分别扩增cry1Ac和cry2Aa基因,利用Red/ET同源重组技术构建cry2Aa与cry1Ac的C-端区域编码序列形成的融合基因,将含该融合基因的表达载体转化至Bt无晶体突变株XBU001中。对重组菌株进行相差显微镜和扫描电镜观察,并对表达产物进行SDS-PAGE分析和质谱鉴定。进一步对融合蛋白的碱溶性、胰酶激活特性及对棉铃虫(Helicoverpa armigera)的毒力进行分析测定。结果表明,重组菌株能产生不定形的伴胞晶体并表达130 kDa的融合蛋白。在pH 10.5的环境下,融合晶体蛋白和Cry1Ac晶体蛋白均可溶解出80%的原毒素,而Cry2Aa晶体蛋白只能溶解出10%的原毒素,且融合蛋白能够被胰蛋白酶正常激活。此外,当Cry1Ac/Cry2Aa晶体蛋白按不同的比例组合时,对棉铃虫的毒力显示出增强效果,而Cry1Ac/Cry2Aa-1Ac则具有明显的协同活性。由此我们得出结论,Cry1Ac原毒素的C-端区域能够增强Cry2Aa晶体的溶解性及其在昆虫中肠道的毒力。130～140 kDa的Cry1类原毒素非毒性C-端区域中富含半胱氨酸(Cys)残基,研究者普遍认为这些Cys残基对原毒素组装形成晶体具有重要作用。本研究前期基础已成功构建有HD73菌株的cry1Ac基因C-端区域14个Cys单点突变以及逐一叠加突变的Bt菌株。为了更深入研究非毒性区域Cys残基的功能,对所有突变菌株进行扫描电镜观察,发现所有突变菌株依然能形成典型的菱形晶体。对野生Cry1Ac蛋白及C-端Cys残基全部突变的Cry1Ac蛋白溶解性和胰酶稳定性分析发现,C-端全部突变的Cry1Ac蛋白在pH 7.5时就可少量的溶解,而野生的Cry1Ac蛋白要在pH 9.5时才能溶解,说明突变后提高了 Cry1Ac蛋白在偏中性pH值中的溶解度,同时还发现突变型晶体蛋白对胰蛋白酶更加敏感,容易在短时间内降解成毒性片段。研究野生Cry1Ac和C-端全部突变的Cry1Ac晶体蛋白对枞色卷蛾中肠细胞系CF203/2.5活性和细胞增殖影响,将两种晶体蛋白毒素以不同浓度梯度作用CF203/2.5细胞48h后,通过倒置显微镜观察发现,与对照相比,两种毒素对细胞都具有毒性,可以发现细胞聚集成团,细胞生长受到抑制、数量变少,形成很多细胞碎片。同时,利用MTT实验来检测蛋白对CF203/2.5细胞增殖的影响。结果显示,随着两种蛋白浓度的提高,细胞毒性也逐渐增强,呈现浓度依赖性,野生Cry1Ac和C-端全部突变的Cry1Ac蛋白浓度为54 μg/mL时,死亡率分别是69%、82%,说明突变后毒性有明显的提高。综上,我们得出这样的一个结论:Cry1Ac的C-端对晶体形成具有重要作用,但是不一定依赖于Cys残基,这与以前的报道不同。本论文的研究有助于阐明Cry1类原毒素C端非毒性区域的功能,对构建苏云金芽胞杆菌高效杀虫工程菌提供理论依据。