水稻基因启动子OsBTF3p的克隆及其启动活性分析

来源 :中国农业科学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:liongliong486
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植物启动子作为重要的转录调控元件控制着基因在特定组织、发育阶段以及环境条件下的表达。大多数转基因研究使用组成型启动子,进行靶基因过量表达,通常情况下会影响植物生长和发育。发掘和利用组织特异性和诱导型表达的启动子,无论对于基因表达调控机理的研究,还是在转基因研究中加以利用都具有十分重要的科学意义。近年来,一些新型的植物启动子正在被发掘出来,并逐步在转基因研究中加以应用,但有关水稻基因病原菌诱导型启动子的研究鲜有报道。本实验室前期对水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv. Nipponbare)悬浮细胞与水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae,简称Xoo)互作后的表达谱进行了cDNA-AFLP分析,发现了一批受Xoo调控(诱导或抑制)而差异表达的基因。为了从水稻基因中发掘新型的病原菌诱导型启动子,本研究对受Xoo侵染的水稻植株水平中6个差异表达基因的表达进行RT-Q-PCR分析;对其中的OsBTF3编码区上游的启动子序列(OsBTF3p)进行了分子克隆,检测了转基因水稻抗性愈伤组织和植株中OsBTF3p对GUS表达的启动活性。本研究目的在于获得OsBTF3p克隆片段,明确其对靶基因表达的启动作用,为抗病转基因水稻研究提供理论依据和材料。本研究利用RT-Q-PCR方法,分析在受Xoo侵染过程中6个水稻基因(Os74、Os82、Os164、Os190、Os234、Os260)的表达。其中Os74表现为下调表达,在发病期表达量最低;Os82表现为显著的上调表达,在接种Xoo 72 h后,表达量达到最高值;Os164和Os234表现为下调表达,表达量呈递减趋势;Os190与Os260表现为下调表达,表达趋势不呈规律性变化,以上结果与本实验室前期对Xoo与水稻悬浮细胞互作结果相一致。由于Os82在接种Xoo后表现显著的上调表达,可能与Xoo诱导相关。因此,本研究选择Os82(OsBTF3基因)进行基因启动子活性及功能分析。根据OsBTF3基因上游序列设计引物,以水稻基因组DNA为模板,扩增了包括翻译起始位点在内的上游1378bp DNA片段,克隆的序列与GenBank中水稻日本晴的序列一致,命名为OsBTF3p。在OsBTF3p序列中,除包含基本的启动元件及大量的CAAT盒(与增强转录效率有关)外,还包含TCA盒(与水杨酸应答有关)、富含TC重复序列(与胁迫应答相关)、G盒(与信号诱导相关)、W盒(WRKY DNA结合蛋白特异识别位点)、Sp1、I盒、GATA-motif、CATT盒(与光诱导应答相关)、MRE、MBS(MYB结合位点)等;在翻译起始密码子前、5’-UTR后具有一段内含子先导序列,其中包含CAAT盒、TCA盒、I盒、G盒等顺式调控元件。构建OsBTF3p∷GUS融合基因植物表达载体pCAM-OsBTF3p,利用农杆菌介导的水稻遗传转化,经转化子筛选和转基因植株再生等过程,成功地获得了39株OsBTF3p∷GUS转基因水稻植株。用GUS组织化学染色法和荧光活性定量法,检测了OsBTF3p在水稻转基因愈伤组织中对GUS表达的启动活性。与转化无启动子表达载体的愈伤组织对照相比,转化OsBTF3p∷CUS的抗性愈伤组织表现出明显的GUS活性,表明OsBTF3p具有启动功能。对OsBTF3p和CaMV35S启动子驱动的转基因植株进行GUS活性比较分析,发现CaMV35S∷GUS转基因植株根部和叶部所有组织GUS均有高水平表达,而OsBTF3p∷GUS转基因植株GUS表达水平相对较低,只在转基因水稻叶片维管束组织具有表达活性,表明OsBTF3p表现出一定的维管束组织特异性。用GUS荧光活性测定法,对OsBTF3p的Xoo诱导性进行了初步测定。在Xoo侵染12h、24h和72 h时,OsBTF3p驱动的GUS活性均表现为明显的上调表达,表明OsBTF3p具有一定的病原菌诱导活性。
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