研究背景癌症是临床最常见的疾病之一,多种类型的癌最终都容易转移至骨骼,形成骨癌痛。为探讨骨癌痛的发生机制及其治疗方法,研究者们先后建立了各种骨癌痛动物模型。上世纪九十年代末美国的Schiwei等利用溶骨性的NCTC2472纤维肉瘤细胞,将其种植于小鼠股骨骨髓腔内,首次成功建立小鼠股骨癌痛模型。其后小鼠跟骨癌痛模型及肱骨癌痛模型相继被成功建立。本世纪初英国学者Medhurst等将MRMT-1大鼠乳腺癌细胞接种在SD大鼠胫骨骨髓腔内,成功建立了大鼠胫骨癌痛模型。这之后国内学者也已迅速成功复制出大鼠胫骨癌痛模型。由于利用乳腺癌细胞建立大鼠胫骨癌痛模型手术操作并不复杂,评价方法也很成熟,与临床常见的乳腺癌骨转移比较接近,故这种动物模型为多数研究者选用。临床上治疗骨癌痛的常用药物是吗啡等阿片类药,但病人长期使用吗啡会引起吗啡耐受。吗啡耐受定义为吗啡的镇痛作用下降、持续时间缩短、疼痛敏感化,以至于要达到同等镇痛效果必须加大吗啡的剂量。尽管吗啡耐受的现象早就受到医学界的广泛关注,并且学者们也进行了大量的研究,但目前吗啡耐受的机制并不清楚。目前的观点认为多种神经递质、神经因子、激酶等参与了吗啡耐受的形成。其中有兴奋性氨基酸、P物质、CGRP、NO和PGE2等神经递质表达增多；μ阿片受体与G蛋白失偶联、受体内吞或受体表达下调；NMDA受体表达上调；蛋白激酶A(PKCA)、蛋白激酶C(PKC)、钙调素Ⅱ(CaMⅡ)等细胞内分子表达增加、功能增强等。以往对于慢性吗啡耐受机制的研究都是基于单纯吗啡耐受的动物模型,即通过皮下、腹腔或鞘内连续给予吗啡,以形成药物耐受。但是这种缺少疼痛性损伤的动物模型,与临床状况并不相符。最近,有学者在关节炎疼痛大鼠模型基础上,通过持续鞘内给予吗啡形成慢性吗啡耐受模型,是在以吗啡治疗炎性痛的背景下形成慢性吗啡耐受。本研究结合既往研究资料,试图在乳腺癌胫骨转移模型基础上建立慢性吗啡耐受模型,即骨癌痛-吗啡耐受模型,为癌痛治疗过程中慢性吗啡耐受的机制研究提供更符合临床实际的动物模型。CX3C趋化因子受体1(CX3CR1)是趋化因子Fractalkine的特异性受体,而Fractalkine是趋化因子cc、CXC、C和CX3C这4个家族中唯一的膜结合型趋化因子。CX3CR1属于CX3C受体亚家族,是G蛋白偶联受体,具有7个跨膜片断,表达于上皮细胞、内皮细胞、神经细胞等类型的细胞上。CX3CR1在正常大鼠脊髓背角主要表达在小胶质细胞上。其独特的分子结构和分布特点提示它可能有不同于其它趋化因子受体的特殊功能。Milligan等的研究结果表明,正常大鼠鞘内注射Fractalkine可导致机械性痛觉过敏和热痛觉超敏的发生,且与Fractalkine的剂量有关,该作用是由CX3CR1介导的；神经病理性疼痛模型大鼠鞘内注射CX3CR1中和抗体可延迟痛觉过敏的产生,已有的疼痛敏感化可被减弱；鞘内注射CX3CR1中和抗体后,骨癌痛大鼠产生的机械性痛觉过敏被逆转,并且小胶质细胞活化明显减少。以上研究报道显示CX3CR1及其配体Fractalkine在疼痛的产生和维持中可能起着重要作用。大量研究提示吗啡耐受形成与病理性疼痛可能存在相同的细胞机制,都与痛觉敏感性增加有关。那么,CX3CR1是否也参与骨癌痛-吗啡耐受的形成呢?关于这一点国内外未见报道。基于以上研究背景,本实验拟通过以下四部分的研究,来探讨CX3CR1在大鼠骨癌痛—吗啡耐受形成中的作用及其可能的机制,以期为慢性吗啡耐受提供新的治疗靶点,并为临床上解决慢性吗啡耐受、实现长期有效地治疗癌性疼痛提供新的科学依据：1.建立骨癌痛大鼠吗啡耐受模型,并与单纯吗啡耐受动物模型比较,以评价疼痛损伤基础上的吗啡耐受模型的优点；2.在第一部分研究的基础上,以Realtime-PCR法测定脊髓CX3CR1mRNA水平,观察骨癌痛吗啡耐受大鼠脊髓CX3CR1mRNA的变化情况,以推断脊髓CX3CR1在骨癌痛吗啡耐受形成机制中是否发挥了重要的作用；3.鞘内注射小胶质细胞抑制剂米诺环素,采用Western blot法检测脊髓CX3CR1蛋白,采用免疫组化法检测脊髓小胶质细胞标记物OX-42的表达,观察骨癌痛吗啡耐受大鼠疼痛行为学、脊髓背角CX3CR1蛋白和OX-42的变化,探讨骨癌痛吗啡耐受形成中小胶质细胞与CX3CR1的作用关系；4.鞘内注射CX3CR1中和抗体(anti-FKR),以Western blot法测定CX3CR1蛋白、以免疫组化法检测μ-阿片受体(MOR)和辣椒素受体(TRPV1)在骨癌痛-吗啡耐受大鼠脊髓背角表达的变化,探讨骨癌痛吗啡耐受形成中CX3CR1作用的下游途径,以明确CX3CR1的作用机制。研究方法与结果1.骨癌痛大鼠吗啡耐受模型的建立方法：鞘内置管成功的成年雌性SD大鼠36只,随机分为3组(n=12)：假手术组(S组)、吗啡耐受组(M组)和骨癌痛+吗啡耐受组(BM组)。BM组右侧胫骨上段骨髓腔注入Walker256癌细胞10μl (4×105cells/ml)制备骨癌痛模型,M组注射热灭活的Walker256癌细胞10μl。两组大鼠接种后10天鞘内注射吗啡20μg/kg,2次/d,连续7天。S组仅暴露胫骨上段。分别于接种Walker256癌细胞前、接种后1、3、6、9天、给予吗啡第1、3、5、7、9天时测定机械缩足阈值(MWT)和机械缩足持续时间(MWD),并于接种后9天放射学检查骨质破坏情况。鞘内注射吗啡第9天,患侧足底触摸刺激后3h处死大鼠,取脊髓L4-6节段,采用免疫组化法测定脊髓背角c-fos的表达水平。结果：与基础值相比,S组大鼠接种后各时点MWT、MWD差异均无统计学意义(均为P>0.05)。M组大鼠给予吗啡第5天开始MWT下降,而MWD上升,与S组相比差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与前两组比较,BM组大鼠接种后6、9天MWT值明显降低(P<0.01),而MWD明显升高(P<0.01),且本组所有大鼠接种后9天X线检查骨质破坏评分≥1分；给予吗啡第1、3天MWT值上升,但仍低于S组同一时点(P<0.05),而MWD值下降,但仍高于S组同一时点(P<0.05)；给予吗啡第5天后MWT值下降,明显低于S组(P<0.01),而MWD上升,明显高于S组(P<0.01),与M组同一时点比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)。S组大鼠脊髓背角仅有少量Fos阳性神经元(FLIN)出现；M组FLIN数量显著高于S组(P<0.01)；与M组比较,BM组FLIN数量增加(P<0.05)。2.骨癌痛吗啡耐受大鼠脊髓背角CX3CR1-mRNA的变化方法：40只雌性SD大鼠随机分为三组：空白对照组(C组,n=l0)、假手术组(S组,n=10)、骨癌痛吗啡耐受模型组(BM组,n=20)。C组不作任何处理；S组行假手术,仅暴露右侧胫骨上段；BM组大鼠右侧胫骨上段骨髓腔注入Walker256细胞10μl(4×105)复制骨癌痛模型,第10天开始鞘内给予20μg/kg吗啡(100μl)1日2次,连续7d,制作骨癌痛吗啡耐受模型(同第一部分)。测定各组大鼠接种Walker256癌细胞前(T0)、接种后3、6、9天(即T1、T2、T3)、鞘内注射吗啡第3、7、9天(即T4、T5、T6)各时点的机械缩足阈值(MWT)和机械缩足持续时间(MWD)。C组和S组于T6时,BM组T5、T6时各处死10只大鼠,取L4-L6脊髓,Realtime-PCR法检测CX3CR1-mRNA水平。结果：C组和S组大鼠各时点疼痛行为学指标分别比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。BM组大鼠在鞘内给予吗啡第7天形成较稳定的吗啡耐受,表现为MWT值下降,明显低于C组和S组(P<0.01),而MWD上升,明显高于C组和S组(P<0.01),且脊髓背角CX3CR1-mRNA水平明显高于C组和S组(P<0.01)。3.米诺环素对骨癌痛吗啡耐受大鼠脊髓CX3CR1蛋白表达的影响方法：成年雌性SD大鼠48只,随机分为四组,每组12只：对照组(C组)、假手术组(S组)、骨癌痛吗啡耐受组(BM组)、BM+米诺环素组(BM+m组)。C组不作任何处理；S组大鼠手术暴露右侧胫骨上段；BM组大鼠右侧胫骨上段骨髓腔注入Walker256细胞10μL制作骨癌痛模型,第10天开始鞘内给予20μg/kg吗啡(100pL)1日2次,连续7 d；BM+m组在BM组基础上,吗啡注射完毕后再连续3 d鞘内注射米诺环素0.25 mg/kg,1日1次。分别于接种Walker256癌细胞前(To)、接种后3、6、9天(即T1、T2、T3)、鞘内注射吗啡第3、7、9天(即T4、T5、T6)测定大鼠机械缩足阈值(MWT)和机械缩足持续时间(MWD),各组于T6时处死大鼠,取脊髓L4-6节段组织,采用Westemblot法测定CX3CR1蛋白表达,免疫组化法检测小胶质细胞标记物OX-42。结果：BM组大鼠在鞘内给予吗啡第7天(T5)形成较稳定的吗啡耐受,表现为MWT值下降,明显低于C组和S组(P<0.01),而MWD上升,明显高于C组和S组(P<0.01),与BM组比较,T6时BM+m组大鼠MWT上升,而MWD下降,差异有统计学意义(均为P<0.05)。BM组大鼠吗啡耐受形成后脊髓背角CX3CR1蛋白和OX-42表达明显高于C组和S组(P<0.01),而BM+m组注射米诺环素后脊髓CX3CR1蛋白和OX-42表达低于BM组(P<0.05)4.拮抗CX3CR1对骨癌痛大鼠吗啡耐受的影响方法：选取48只成年雌性SD大鼠,其中36只按照第一部分的方法制作骨癌痛吗啡耐受模型,随机分为3组,每组12只,即鞘内给予生理盐水组(AM组),鞘内给予IgG组(GM组)和鞘内给予CX3CR1中和抗体组(BM组),其余12只大鼠为对照组(A组),仅手术暴露右侧胫骨上段,并经鞘内注射生理盐水。各组连续鞘内注射3天(容量均为10μ1),1日1次。分别于接种Walker256乳腺癌细胞前(基础值T0)、接种后第3、6、9d、给予吗啡第3、7d、鞘内注射抗体第3 d(T1-T6)时测定机械缩足阈值(MWT)和机械缩足持续时间(MWD)来衡量各组大鼠行为学的改变,各组于T6时处死大鼠,取脊髓L4-6节段组织,以westemblot方法检测脊髓背角CX3CR1蛋白的表达,以免疫组化方法检测脊髓背角神经元μ-阿片受体(MOR)和辣椒素受体(TRPV1)的表达。结果：AM、GM和BM三组大鼠在鞘内给予吗啡第7天形成较稳定的吗啡耐受,表现为MWT值下降,明显低于A组(P<0.01),而MWD上升,明显高于A组(P<0.01),BM组鞘内注射中和抗体3天后两指标与AM和GM组比较差异也有统计学意义(均为P<0.05)。AM和GM组大鼠吗啡耐受形成后脊髓背角CX3CR1蛋白和TRPV1明显高于A组(P<0.01),MOR明显低于A组(P<0.01),而BM组注射中和抗体后脊髓CX3CR1蛋白和TRPV1明显低于AM和GM组(P<0.05),MOR明显高于AM和GM组(P<0.05)。5.统计学分析计量资料以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS 11.0软件进行数据处理,机械缩足阈值和机械缩足持续时间的比较均采用重复变量数据的方差分析,其余结果比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。研究总结一、主要研究结果1.通过疼痛行为学观察和免疫组织化学检测表明,成功建立了大鼠骨癌痛-吗啡耐受模型,与单纯吗啡耐受模型相比,该动物模型更符合临床实际。2.骨癌痛-吗啡耐受大鼠脊髓背角CX3CR1-mRNA的表达显著增强。3.骨癌痛-吗啡耐受大鼠鞘内注射小胶质细胞抑制剂米诺环素后,产生了显著的镇痛效应,且脊髓背角CX3CR1蛋白表达下降,说明脊髓CX3CR1可能在骨癌痛大鼠慢性吗啡耐受的形成机制中发挥重要作用,小胶质细胞活化后使脊髓CX3CR1蛋白表达上调。4.鞘内注射CX3CR1中和抗体可以通过抑制脊髓背角CX3CR1而翻转MOR下调和TRPV1上调,从而缓解骨癌痛大鼠吗啡耐受。二、研究结论脊髓CX3CR1在骨癌痛大鼠吗啡耐受形成中发挥了重要作用,脊髓小胶质细胞活化后CX3CR1蛋白和CX3CR1mRNA表达均增加,继而促使神经元MOR下调和TRPV1上调,这可能是CX3CR1参与骨癌痛-吗啡耐受形成的机制之一。三、研究意义本研究建立大鼠骨癌痛-吗啡耐受模型,在此基础上探讨脊髓CX3CR1在骨癌痛大鼠吗啡耐受形成中的作用及其机制,证实了脊髓CX3CR1在骨癌痛大鼠吗啡耐受形成中起着重要的作用,下调神经元MOR和上调TRPV1是其作用机制之一,这为慢性吗啡耐受提供了新的治疗靶点,并为临床开发新的药物,解决慢性吗啡耐受、实现长期有效地治疗癌性疼痛提供新的科学依据。