花色苷是一种黄酮类化合物,不仅具有鲜艳的颜色,而且有显著的药理活性。目前,花色苷做为一种天然色素和功能性的成分已经被用于食品、化妆品和药品等领域。唐古特白刺(Nitrariatangutorun Bobr.)和黑果枸杞(Lycium ruthenicumMurr.)广泛分布于中国青藏高原,被做为传统药用食物已有几千年的历史。研究表明唐古特白刺和黑果枸杞是花色苷的优质来源。绿色化学旨在减少或限制使用和产生对人类和环境有害的原料、产品和试剂等。在天然生物活性化合物的提取过程中,开发和使用绿色的提取技术、提取溶剂和分析方法有重要意义。本实验拟建立绿色的提取、分离、分析和鉴定唐古特白刺和黑果枸杞花色苷的方法。主要研究内容与结果如下:1.唐古特白刺果实已经被开发为果汁、干红酒和复合种油软胶囊等产品,因此产生了大量的唐古特白刺籽粕。根据HPLC-DAD-ESI-MS数据,本实验从唐古特白刺籽粕中初步鉴定出8种花色苷。因此,开发这种食品工业副产物有利于解决资源浪费等问题。本实验采用响应面法优化了唐古特白刺籽粕花色苷超声波辅助提取工艺。最佳提取条件为:提取温度70 ℃,提取溶剂51.15%乙醇溶液和提取时间32.73 min,在此条件下总花色苷和总多酚的得率分别为65.04 mg/100 g和947.39 mg/100 g。2.双水相提取属于液液提取技术,被认为是一种环保的方法。盐-醇双水相提取技术将固液提取和液液萃取合二为一,能够同时提取和纯化植物中花色苷类化合物。为促进双水相提取技术在花色苷提取方面的应用,本实验研究比较了不同极性花色苷在NaH2PO4/(NH4)2S04-乙醇双水相中的分配行为,并优化了唐古特白刺和黑果枸杞花色苷双水相提取工艺。花色苷在NaH2PO4/(NH4)2S04-乙醇双水相中的分配系数随着其疏水性的增加而增加,酰化花色苷等极性较小的花色苷更加容易被分配到上相。与(NH4)2S04-乙醇双水相系统相比,NaH2P04-乙醇双水相系统有更高的总花色苷得率以及更大的总花色苷与总糖的分离度。最佳的唐古特白刺总花色苷双水相提取条件为:提取温度65 ℃、提取时间45 min、NaH2P04浓度28%和乙醇浓度26%,在此条件下唐古特白刺总花色苷得率为3.62 ± 0.05 mg/g。最佳的黑果枸杞总花色苷双水相提取条件为:提取温度45.5 ℃、提取时间45 min、NaH2P04浓度28%和乙醇浓度26%,在此条件下黑果枸杞总花色苷得率为13.16 ± 0.29 mg/g。唐古特白刺和黑果枸杞总花色苷回收率分别为98.91 ±0.03%和99.84 ± 0.01%,总糖脱除率均大于70%。3.绿色分析化学是绿色化学的一个分支,旨在减少或限制有毒有害物质的使用与产生。乙腈和甲醇等有毒有机试剂常做为花色苷HPLC分析的流动相。乙醇是一种绿色的溶剂,能够代替乙腈和甲醇做为HPLC流动相。为了提高花色苷的色谱分离效果,三氟乙酸和甲酸溶液常用于花色苷HPLC分析。三氟乙酸有高的生态毒性,且不易降解,而甲酸毒性较低且易于生物降解为二氧化碳和水。因此,本实验建立了一种唐古特白刺籽粕花色苷HPLC-DAD分析方法,流动相组成为20%的乙醇和80%的甲酸溶液(5%,v/v)。但是,甲酸极易挥发且有刺激气味,直接接触液态甲酸或吸入甲酸蒸汽均能够损害人体健康。为了开发更加安全、绿色的流动相,本实验研究比较了柠檬酸、苹果酸、葡萄酸、乳酸、甘醇酸、扁桃酸和抗坏血酸等果酸(又被称为α-羟基酸)溶液对唐古特白刺和黑果枸杞花色苷HPLC色谱行为的影响。结果表明葡萄酸溶液更适合用于花色苷HPLC分析。用于唐古特白刺花色苷HPLC分析的流动相为乙醇和0.1 mol/L的葡萄酸溶液,16 min内能够检测到15个花色苷色谱峰。用于黑果枸杞花色苷HPLC分析的流动相为乙醇和0.3 mol/L的葡萄酸溶液,17 min内能够检测到15个花色苷色谱峰。4.溶剂是绿色化学一个重要的关注点。作为一种绿色的溶剂,低共熔溶剂受到了科学家的关注,被誉为“21世纪的溶剂”。本实验使用低共熔溶剂提取唐古特白刺和黑果枸杞花色苷,以氯化胆碱-1,2-丙二醇为基础的低共熔溶剂有较高的花色苷提取效率。使用单因素实验和响应面实验对唐古特白刺和黑果枸杞总花色苷低共熔溶剂提取条件进行了优化。唐古特白刺总花色苷最优的低共熔溶剂提取条件为:提取温度68 ℃、氯化胆碱/1,2-丙二醇摩尔比1:3.4、含水量20%、液料比15:1和提取时间45 min,在此条件下唐古特白刺总花色苷得率为1.413 ±0.054 mg/g。黑果枸杞总花色苷最优的低共熔溶剂提取条件为:提取温度52 ℃、氯化胆碱/1,2-丙二醇摩尔比1:3、含水量10%、液料比20:1和提取时间45 min,在此条件下黑果枸杞总色苷得率为4.45 ± 0.07 mg/g。5.由于低共熔溶剂不易挥发,所以从中分离非挥发性的化合物不能通过加热浓缩的方法实现。在分离纯化技术中,大孔树脂受到了科学家的重视。本实验研究了大孔树脂对低共熔溶剂中花色苷的分离效果。基于静态和动态吸附解析实验结果,LX-32大孔树脂被用于分离低共熔溶剂中唐古特白刺和黑果枸杞花色苷,总花色苷回收率均大于95%。6.本实验使用乙醇和0.1%的甲酸溶液做为UPLC-Q-TOF-MS的流动相,分别从唐古特白刺和黑果枸杞中初步鉴定了 13种和16种花色苷类化合物。本实验结果表明:唐古特白刺籽粕能够用于花色苷的提取;双水相提取技术和低共熔溶剂提取结合大孔树脂分离技术能够用于唐古特白刺和黑果枸杞花色苷的制备分离;乙醇和果酸溶液为基础的流动相能够用于唐古特白刺和黑果枸杞花色苷的HPLC分析。本实验能够促进绿色提取和绿色色谱技术在天然生物活性化合物研究与开发方面的应用。