不同倍性虹鳟(Oncorhychus mykiss)精子入卵与受精细胞学研究

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虹鳟Oncorhynchus mykiss(Walbaum)隶属于硬骨鱼纲(Osteichthyes)、鲑形目(Salmoniformes)、鲑科(Salmonidae)、鲑亚科(Salmonidae)、大马哈鱼属(Oncorhynchus),原产于北美洲西部的太平洋沿岸,是最早开始人工养殖且养殖分布最广的名贵冷水鱼类之一。1959年引入我国,距今已有50年的养殖历史,但我国的养鳟技术很多仍是由国外引进,因此虹鳟的基础性研究仍然具有重要的理论指导意义。   本文进行了虹鳟2n(♀)×4n(♂)精子入卵、2n(♀)×3n(♂)受精细胞学过程及2n(♀)×2n(♂)受精率时间点的研究,旨在为虹鳟等冷水性鱼类人工繁殖、苗种培育、遗传育种和提高受精率、孵化率提供理论依据和技术指导。扫描电镜观察虹鳟四倍体精子进入二倍体卵子的全过程,结果显示:四倍体虹鳟精子为典型的鞭毛型结构,由头部、颈部、尾部三部分组成;无顶体,颈部明显,头部长径为3.22±0.21μ m,短径为2.88±0.22μm。二倍体虹鳟卵子受精孔位于卵膜动物极环状隆起包围的漏斗状凹陷中央,由前庭和精孔管道两部分组成;前庭较浅,开阔、平坦,近似圆形,直径33.1±0.16μ m:精孔管道较深,看不到底部,开口处呈圆环状,直径(外径)为6.67±0.19μm,管道内壁环状螺旋嵴组成,一直延伸至底部,直径(内径)为4.84±0.17μ m。干法授精未加水前,卵子受精孔没有絮状物覆盖,呈关闭状态;精卵相遇1s、3s、5s、10s后,没有任何精子到达前庭,大多精子粘附于精孔区域外,受精孔一直处于关闭状态。干法授精加水后1s,位于卵膜表面的受精孔开启,此时开口较小,没有精子到达精孔区。授精3s后,精孔开口变大,前庭和精孔管道结构清晰。授精5s后,卵膜外表面有大量精子粘着,尤以精孔器附近居多;少数活力强的精子越过环状隆起到达精孔器口,精子头部与精子进入区中央的入卵位点接触,精子尾部则在受精前庭游动。授精10s后,靠近受精孔附近的大部分精子的头部朝向精孔口,而远离受精孔的精子则头部朝向混乱;到达精孔器口的精子头部与精孔管壁相贴,沿螺旋式通道进入卵子。授精20s后,精子沿着孔道壁顺序进入孔道。授精30s后,精孔器口的精子的头部全部进入孔道,尾部则留在孔道壁和受精前庭。授精40s后,在精孔器入口处出现零散的瓦状碎片堵塞物,这些零散的堵塞物形成“受精栓”,迟到的精子被堵塞在精孔道外,不能够进入。授精50s后,精孔器入口处零散的瓦片状堵塞物发生融合,精孔道大面积地被堵塞,此时精子已经完全无法进入受精孔道。授精60s后,精孔器入口处形成完整的半圆状颗粒状堵塞物,将受精孔道完全堵塞,入口处部分精子的尾部留在精孔道外,还未被降解。   本研究采用组织切片观察了虹鳟2n(♀)×3n(♂)受精细胞学全过程,结果显示:杂交胚胎可以顺利完成受精过程,受精程序与大多数硬骨鱼类相同,包括精卵质膜识别和融合、雄原核形成、卵母细胞第二次成熟分裂、第二极体排出、雌原核形成、雌雄原核融合形成合子并快速进入第一次卵裂。第一次卵裂后开始,杂交胚胎开始发育不正常,表现在受精率开始下降,卵裂不正常现象增加,杂交胚胎多数在发眼期之前死亡,破膜的胚胎在仔鱼期上浮前全部死亡。本研究认为,造成这种情况的原因主要有两种:①染色体分配不均匀,导致非同源染色体间发生了复杂的联会,产生部分同源染色体配对的障碍,形成了非整倍体配子,导致受精率较低。②染色体非整倍体化可能会引起杂交胚胎细胞核质不相容,进而导致基因表达调控紊乱,从而使杂交胚胎不能正常发育,无法完成由母体卵黄供给的内源营养向外源营养的转换,成为导致杂交胚胎发育过程中大量死亡,以及杂交仔鱼在破膜之后开始进食之前全部死亡。采用鉴别液和Bouins液固定剥膜两种方法,测定二倍体虹鳟受精率,结果显示:虹鳟受精率测定的取样时间为卵裂期,尤以桑椹期最佳;鉴别液和Bouins液测定受精率两者效果差异不显著(P>0.05),但鉴别液更加快速、方便,也更易于生产实践的推广。
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