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第一部分人脐带间充质干细胞治疗脑肿瘤的探讨性研究目的探讨人脐带间充质干细胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells, HUCMSCs)有对肿瘤定向迁移作用可以作为理想的基因治疗载体以及间充质干细胞本身分泌一些细胞因子可以抑制肿瘤生长的双向治疗途径的优势,进行在细胞生物学上和分子生物学上对肿瘤细胞促使肿瘤细胞凋亡的影响和作用机制研究。方法利用人脐带组织经胶原酶消化后提取间充质干细胞,经流式细胞技术鉴定表面标志物,传代培养,利用Transwell小室试验,以BV2小胶质细胞为正常对照,观察间充质干细胞对肿瘤细胞的迁移作用,间充质干细胞和肿瘤细胞共培养、明胶酶谱和反向明胶酶谱来观察间充质干细胞对肿瘤细胞的抑制作用的细胞生物学效应,结果Transwell小室可见间充质干细胞对肿瘤迁移显著,间充质干细胞和U251肿瘤细胞共培养可观察到U251肿瘤细胞的细胞间质呈现空泡样变化,一个星期左右肿瘤细胞破碎、凋亡,而间充质干细胞和肿瘤干细胞分别用不同的荧光染料共培养后,亦可见间充质干细胞和肿瘤干细胞相互迁移整合在细胞间质,明胶酶谱和反向明胶酶谱可见间充质干细胞可分泌类组织金属蛋白酶抑制剂(TIMP)抑制肿瘤细胞分泌的基质金属蛋白酶(MMPs)。结论间充质干细胞有向肿瘤定向迁移的作用,并且其可以分泌细胞因子作用于肿瘤细胞,促使肿瘤细胞生长的抑制和促进肿瘤细胞的凋亡；在作为基因治疗来说,是一个很理想的基因载体,另一方面可以抑制肿瘤细胞的生长,对于使用间充质干细胞可以治疗肿瘤的特性,结合基因治疗肿瘤的治疗途径是一个很理想且一举两得的治疗方式。第二部分构建慢病毒载体转染干扰CHKl/2基因对脑胶质瘤放疗抑制抵抗性的研究目的构建慢病毒载体转染干扰CHK1/2 (checkpoint kinase 1/2)基因。为研究干扰CHKl/2基因的表达对脑胶质瘤细胞放疗抵抗性的抑制进而增加放疗的敏感性,促进肿瘤细胞的凋亡。方法根据GenBank数据提供的Chkl及Chk2基因核苷酸序列,各选择设计一条适合转录短发夹RNA (Small hairpin RNA, shRNA)的DNA序列,与pLK0.1质粒载体链接,转化感受态大肠杆菌,选择单克隆,提取质粒,使用限制性内切酶EcoRI及Ncol酶切,琼脂糖凝胶电泳,DNA序列鉴定。通过慢病毒转染胶质瘤细胞系U251进行传代扩增。将转染的U251胶质瘤细胞系经紫外线照射后,用RT-PCR和Western blot方法分别在mRNA和蛋白水平上测定CHKl及CHK2的表达。结果重组质粒成功转化感受态大肠杆菌,经EcoRI及Ncol酶切后琼脂糖凝胶电泳结果,表明寡核苷酸成功插入到所计划的位点,测序鉴定正确,转染MSC组(对照)和U251组mRNA和蛋白水平表达几乎一致,经紫外线照射后Chkl、Chk2基因表达明显减弱。结论成功构建干扰Chk1、Chk2的shRNA表达,转染后的细胞可抑制Chk1、Chk2基因的表达,进而为增加肿瘤放疗敏感性的研究和临床治疗奠定了很好的理论基础。第三部分干扰下调Chk1/Chk2基因的表达对慢病毒转染后胶质瘤细胞信号通路增加放疗敏感效应研究目的研究通过慢病毒转染干扰CHKl/2 (Checkpoint kinase 1/2)基因后使得无法传达下调信号cdc25家族成员和其他底物无法磷酸化,损伤信号无法传递到下游,而使得细胞周期无法阻止,损伤修复等生物学任务传递失效,损伤的DNA错配或者复制压力增加而造成复制失败或错配后导致蛋白质无法发挥正常的生物学校应导致细胞凋亡。方法将U251肿瘤细胞系通过慢病毒转染干扰CHKl/2基因的表达,使用紫外线和X-ray照射细胞,比较没有经过干扰的肿瘤细胞和干扰后的肿瘤细胞的生物学变化和生存时间,通过RT-PCR、Real-time PCR和Westrn blot检验RNA和蛋白质水平。结果经过转染干扰基因的肿瘤细胞受到离子和非离子射线照射后相较于没有经过干扰基因转染的肿瘤细胞生存时间短,在RNA和蛋白质水平可见所表达的差异。结论CHK1/2是磷脂酰肌醇-3-激酶样激酶家族(PIKKs, phosphatedyl-inositol-3-kinase- like protein kinases)成员,ATM、ATR的下游底物,在经过离子辐射、紫外线辐射等引起DNA损伤时被激活,但慢病毒转染U251胶质瘤细胞系干扰CHKl、CHK2基因的表达,针对因为离子和非离子照射后导致启动细胞周期检测点信号通路ATM/ATR-CHK1/CHK2-Cdc25引起的周期阻滞进行其中的干扰,使得信号通路无法传达下调信号而起到细胞周期阻滞,故而对于放疗引起的肿瘤损伤无法起到静止周期的进行来修复DNA损伤,从而引起肿瘤细胞的凋亡。