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目的:通过小剂量雷公藤内酯醇(TPL)联合顺铂(DDP)作用于耐顺铂人卵巢癌细胞SKOV3/DDP,观察两药联合对其体外活性的影响以及两药联合是否具有协同作用,并对TPL可能的抗肿瘤作用机制以及对DDP增敏作用机制进行初步探讨方法:1.SKOV3/DDP细胞的传代培养:在37℃、5%CO2、饱和湿度的恒温培养箱内,用含有10%FBS和100u/ml青、链霉素的RPMI-1640培养基培养SKOV3/DDP细胞。待细胞长满培养瓶底部的80%-90%,常规消化、离心、更换培养基后,按1:3的比例传代接种。2.MTT法检测顺铂(DDP)对SKOV3/DDP细胞增殖的影响:不同浓度的DDP(0.3125μg/ml、0.625μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml)分别作用于SKOV3/DDP细胞24h、48h、72h后用MTT法检测OD值。观察不同浓度DDP、作用不同时间后对SKOV3/DDP细胞增殖的影响,计算抑制率以及IC50值、IC10值。3.MTT法检测雷公藤内酯醇(TPL)对SKOV3/DDP细胞增殖的影响:不同浓度的TPL(0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、16ng/ml、32ng/ml、64ng/ml)分别作用于SKOV3/DDP细胞24h、48h、72h后用MTT法检测OD值。观察不同浓度TPL、作用不同时间后对SKOV3/DDP细胞增殖的影响,计算抑制率以及IC50值、IC10值。4.MTT法检测DDP联合TPL对SKOV3/DDP细胞增殖的影响:TPL组(浓度为:0.5ng/ml、2ng/ml、8ng/ml)和DDP组(浓度为:0.3125μg/ml、1.25μg/ml、5μg/ml)以及DDP联合TPL组,分别作用于SKOV3/DDP细胞24h后用MTT法检测OD值,计算出各组药物对SKOV3/DDP细胞的抑制率,并根据Chou-Talalay法计算出两药的药物联合指数CI值。5.流式细胞术检测DDP联合TPL对SKOV3/DDP细胞凋亡的影响:用空白对照组、TPL(0.5ng/ml)组、DDP(10μg/ml)组及DDP(10μg/ml)联合TPL(0.5ng/ml)组分别处理SKOV3/DDP细胞24 h后,应用Annexin V-FITC/PI法处理后置于流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。6.Western blot法检测DDP联合TPL对SKOV3/DDP细胞Smac蛋白、Survivin蛋白以及Caspase-3蛋白表达水平的影响:用空白对照组、TPL(0.5ng/ml)组、DDP(10μg/ml)组及DDP(10μg/ml)联合TPL(0.5ng/ml)组分别处理SKOV3/DDP细胞24 h后,应用Western blot法检测各组细胞Smac蛋白、Survivin蛋白以及Caspase-3蛋白表达水平。结果:1.通过观察SKOV3/DDP细胞生长曲线,得知SKOV3/DDP细胞培养24-72h细胞生长状态最佳,为细胞的对数生长期,因此明确细胞培养24-72h为药物最佳干预时间。2.DDP浓度越高、作用时间越长,其对SKOV3/DDP细胞的增殖抑制作用越大。DDP作用SKOV3/DDP细胞24h后IC50为9.383μg/ml,IC10为0.102μg/ml,作用48h后IC50为3.426μg/ml,作用72h后IC50为1.769μg/ml。3.TPL浓度越高、作用时间越长,其对细胞的增殖抑制作用越大。TPL作用SKOV3/DDP细胞24h后IC50为14.197ng/ml,IC10为0.597ng/ml,作用48h后IC50为6.5ng/ml,作用72h后IC50为2.994ng/ml。4.选取低、中、高TPL浓度组(0.5ng/ml、2ng/ml、8ng/ml)和低、中、高DDP浓度组(0.3125μg/ml、1.25μg/ml、5μg/ml)以及DDP联合TPL组分别处理SKOV3/DDP细胞24h,结果发现各浓度联合组均比相对应浓度的TPL组、DDP组抑制率高,差异具有统计学意义(P<0.01),TPL和DDP的药物联合指数CI<1。5.用空白对照组、TPL(0.5ng/ml)组、DDP(10μg/ml)组及DDP(10μg/ml)联合TPL(0.5ng/ml)组分别处理SKOV3/DDP细胞24 h后,细胞平均凋亡率分别为对照组4.66%±0.93%,TPL组为8.33%±0.96%,DDP组为19.82%±2.56%,DDP组联合TPL组为24.73%±2.01%,与空白对照组相比,TPL组、DDP组、联合组的细胞凋亡率升高,差异具有统计学意义(P<0.01),与TPL组、DDP组相比,联合组的细胞凋亡率升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。6.用空白对照组、TPL(0.5ng/ml)组、DDP(10μg/ml)组及DDP(10μg/ml)联合TPL(0.5ng/ml)组分别处理SKOV3/DDP细胞24 h后Western blot结果显示,与空白对照组相比,TPL组、DDP组、联合组Smac蛋白、Caspase-3蛋白表达均上调,Survivin蛋白表达均下降,差异具有统计学意义(P<0.01);与TPL组、DDP组相比,联合组Smac蛋白、Caspase-3蛋白表达上调,Survivin蛋白表达下降,差异具有统计学意义(P<0.05),TPL组与DDP组Smac蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1.TPL和DDP均对体外培养的耐顺铂人卵巢癌细胞(SKOV3/DDP)的增殖具有抑制作用,药物的浓度越高、作用时间越长,其对细胞的抑制作用越明显,且0.5ng/ml小剂量TPL可以协同增强DDP对SKOV3/DDP细胞的抑制作用。2.TPL和DDP均能诱导SKOV3/DDP细胞凋亡,且0.5ng/ml小剂量TPL可以协同增强DDP对SKOV3/DDP细胞凋亡的诱导作用。3.TPL诱导SKOV3/DDP细胞凋亡、对DDP增敏作用机制可能与促凋亡蛋白Smac、Caspase-3表达上调,抑凋亡蛋白Survivin表达下降有关。