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辅酶价格昂贵且回收困难,氧化还原酶对辅酶的依赖限制了其在工业化生产中的大规模应用。因此,有大量的实验研究辅酶再生,其中构建多酶体系是一种常用的方法。在这些研究中,研究人员常常注重目标产物的生成,而忽略了多酶偶联体系中辅酶的传递规律。本实验以酵母乙醇脱氢酶(ADH)作为研究模板,运用不同的实验手段探究ADH与辅酶I (NAD+/NADH)结合情况,旨在解释辅酶与酶的结合规律,为酶反应机理提供依据,本文主要研究内容和结果如下：一、运用红外光谱的方法对NAD+、NADH和ADH做了固相透射和液相反射的红外光谱,并对检测到的特征谱峰进行了归属；利用差谱法分别得到了水溶液和重水溶液中乙醇脱氢酶与NAD+、 NADH结合的红外谱图,发现NAD+、 NADH中腺嘌呤基团都会与乙醇脱氢酶活性中心的氨基酸残基发生氢键结合。此外,NAD+的烟酰胺基团与乙醇脱氢酶的氨基酸残基之间也会形成氢键。同时利用电化学原位监测了NAD+/NADH的相互转化,发现NAD+在电极表面易生成二聚体,会引发电极副反应的产生,仅仅在电压作用下很难还原成NADH。而在0.1V就可检测到NADH的氧化产物NAD+。二、将乙醇脱氢酶与碳纳米管、壳聚糖制备成生物复合膜固定在玻碳电极表面,构建了乙醇脱氢酶生物传感器,利用电化学反应灵敏度高的优点,考察了乙醇脱氢酶与辅酶NAD+、底物乙醇的催化机制,我们发现在电极表面发生氧化还原之后ADH与辅酶NAD+并非马上解离,而二者结合的氢键被破坏时二者就会发生解离。此外,在外加电场的作用下,二者的解离也没有减缓,反而减低了电极活性。三、利用化学法和物理交联法将ADH固定在EQCM金电极表面,借助电化学原位检测并同时记录电极表面质量的变化,初步探索了电极表面酶与NAD+/NADH结合情况,将修饰电极在1mM NADH溶液中做计时电流实验,在0.7V电压下NADH氧化生成NAD+,发现电极表面的质量减小,这一现象说明ADH与NADH的结合力大于NAD+。