高效毛细管电泳在二氢叶酸还原酶反应动力学研究中的应用

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毛细管电泳法以其进样量少、操作简便、分辨率高、易于分离和定量、试剂消耗量少、分析时间短等优点,越来越广泛地应用于酶体系的动力学研究中。本文介绍了高效毛细管电泳法在测定二氢叶酸还原酶反应动力学研究中的应用,包括酶反应动力学参数的测定、抑制动力学以及二氢叶酸还原酶的分离检测。 通过毛细管电泳法研究分离二氢叶酸还原酶体系中二氢叶酸、四氢叶酸、NADP、NADPH和酶五种物质,在含0.002%Brij-35的pH9.18 50 mmol/L的硼砂缓冲溶液中,五种组分在18 min内得到基线分离。通过对其产物四氢叶酸峰面积的定量测定,计算出二氢叶酸还原酶的米氏常数,建立了毛细管电泳法对二氢叶酸还原酶活力的测定方法。 研究了一种毛细管电泳法测定二氢叶酸还原酶(DHFR)反应抑制动力学参数的新方法。通过已经建立的毛细管电泳法对二氢叶酸还原酶体系的分离条件,研究在酶反应过程中反应物和反应产物的浓度变化,来计算有关反应动力学参数。将已知的氨甲喋呤、甲氧苄胺嘧啶和叶酸三种抑制剂作用于本文所建立的二氢叶酸还原酶体系,发现测得抑制剂的半数抑制浓度与文献值相符,证明本体系可用于二氢叶酸还原酶抑制剂的筛选。 研究建立了毛细管电泳法对二氢叶酸还原酶进行分离的方法,对其提取步骤进行了监测。毛细管电泳分离运行缓冲液为含0.05%羧甲基纤维素的pH9.18 50 mmol/L的硼砂缓冲溶液,分离温度25℃,分离电压25kV,进样压力0.5 psi.(1 psi.=6894.76 Pa),进样时间10s,检测波长214nm,电流62μA,峰形良好。将所建立的方法用于监测二氢叶酸还原酶的提取过程,进一步证明,该提取过程是一个不断纯化的过程。 另外,本文还做了一些荧光方面的工作,比较了测定叶酸的三种荧光分析体系方法的分析性能和应用,详细研究了叶酸内在荧光,KMnO4—光照和H2O2—光照荧光体系。结果表明,叶酸内在荧光较弱,而用衍生方法进行测定,灵敏度可以提高2~3个数量级。在研究的三种体系中,KMnO4—光照法具有适宜的灵敏度和较宽的线性范围,可用于蔬菜样品中叶酸的测定,标准回收率在92.5%~95.0%之间,测定结果令人满意。
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