叉舌蛙科(Dicroglossidae)部分濒危物种和中华虎凤蝶(Luehdorfia chinensis)基因条形码鉴定技术与评价

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我国野生蛙类动物资源丰富,不少物种经人工养殖后具有食用和药用的经济价值。然而,由于市场需求的扩大和现有养殖规模的不对等,再加上自然繁育数量稀少,人们的过分捕杀,使得部分物种进入濒危状态。另一方面,巨大的供应缺口驱使不法商贩在市场上兜售混伪品,使得在实际的市场交易中很难区分这类资源的真伪。目前市场上所售的所谓的棘胸蛙(Quasipaa spinosa)90%以上都是药用价值很低的棘腹蛙(Quasipaa boulengeri)。中华虎凤蝶(Luehdorfia chinensis)是我国特有的珍贵蝶类,由于环境破坏栖息地的减少,现已列入濒危状态,准确的鉴别并保护该物种迫在眉睫。基因条形码(DNA Barcode)技术是从基因层面上鉴别物种,具有较高的准确性。本研究通过测定濒危食用兼药用动物叉舌蛙科(Dicroglossidae)物种棘胸蛙、棘腹蛙、虎纹蛙(Hoplobatrachus rugulosus)和濒危物种中华虎凤蝶的 COI(Cytochrome Oxidase SubunitI,COI)和16S rRNA(16S ribosomal RNA)基因序列来评价这两个基因作为基因条形码在该物种鉴定中的适用性,并通过遗传距离分析和系统进化分析验证了DNA条形码以及其分析方法的有效性,取得的主要研究结果如下:1.COI和16S rRNA基因序列作为DNA条形码在叉舌蛙科(Dicroglossidae)部分濒危物种鉴定中的应用本研究分别提取3种蛙共17个野生个体的肌肉组织DNA,扩增其COI和16S rRNA基因片段并测序,其中COI序列为658bp,16S rRNA序列为555bp。从遗传距离分析、基因条形码间隙分析和系统聚类分析三方面评价了这两个基因作为DNA条形码的效用性。结果表明:同属内种间遗传距离明显大于种内遗传距离,两者之间形成明显的间隔区。基于COI基因的3种蛙的种间遗传距离(0.1681-0.2929)明显大于种内遗传距离(0.0005-0.0157);基于16S rRNA基因的3种蛙的种间遗传距离(0.0450-0.2232),明显大于种内遗传距离(0.0005-0.0198)。NJ树和ML树中不同种蛙类各自形成单系群,COI和16S rRNA基因在种和属的水平方面的鉴定作用与传统分类学鉴定方法一致,表明这两个基因作为DNA条形码在棘胸蛙、棘腹蛙和虎纹蛙物种的鉴定中具有很好的应用价值。2.COI和16S rRNA基因作为基因条形码在濒危物种中华虎凤蝶的鉴定中的应用本研究分别提取了 3只中华虎凤蝶肌肉组织DNA,采用Primer Premier 5.0设计了 COI基因的引物。扩增并测序得到了中华虎凤蝶COI和16S rRNA基因序列。通过遗传距离分析、基因条形码间隙分析和系统聚类分析三方面评价了所得序列片段作为DNA条形码的有效性。结果表明:同属内种间遗传距离明显大于种内遗传距离,两者之间形成明显的间隔区。其中基于COI基因种间遗传距离(0.0569-0.1533),明显大于种内遗传距离(0.0022-0.0061),其中一对引物HFD3F/HFD3R扩增所得COI序列片段长度为326bp,其种间遗传距离(0.0571-0.1533),明显大于种内遗传距离(0.0014-0.0126);基于16S rRNA基因种间遗传距离(0.0883-0.1606),明显大于种内遗传距离(0.0021-0.0123)。系统聚类分析中,通过构建NJ树和ML树,中华虎凤蝶形成单系群,且其他属不同种蝶类各自形成单系群,说明长度分别为658bp,326bp的COI序列长度为和555bp的16S rRNA序列作为基因条形码在鉴定中华虎凤蝶或其残缺标本具有很好的应用价值。本研究采用遗传距离分析,基因条形码间隙分析,系统聚类分析三种分析方法,对3种17个蛙类物种样品,3个中华虎凤蝶样品的COI、16S rRNA基因进行了条形码适用性分析,结果表明所获得的COI和16S rRNA基因序列均可准确用作DNA条形码。将20条COI、16S rRNA序列上传至濒危物种基因条形码数据库(http://47.102.211.219/data/all/)并生成条形码。
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