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研究背景和目的结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一,近十年来,结直肠癌在我国的发病率有逐年上升的趋势。转移是影响患者治疗效果和死亡的主要原因,探讨与结直肠癌转移相关的因素,寻找有效、特异的转移相关基因并探讨其功能,不仅有利于阐明结直肠癌转移的分子机理,还能为临床诊治、药物筛选及预后判断提供新的靶点。上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transitions,EMT)是指上皮细胞在形态学上发生成纤维细胞或间充质细胞表型的转变,并获得迁移能力,它是一种基本的生理病理现象,在胚胎发育、组织发生中起重要作用。此外,EMT也存在于多种病理过程中,如伤口愈合过程、肾脏纤维化、肿瘤发生及转移。越来越多的研究显示EMT在肿瘤细胞的侵袭和转移中起着重要作用,因而已成为肿瘤研究中的一个热点。在我们的前期研究中,我们筛选出了Formins家族成员之一的FMNL2基因作为一个研究结直肠癌侵袭、转移的新靶点。目前有关FMNL2的研究文献仅有数篇,主要是针对FMNL2的克隆、进化及结构进行分析,而对于FMNL2功能学尤其是肿瘤方面的研究除本课题组外,尚未见其它报道。我们课题组首次探讨了FMNL2在结直肠癌侵袭和转移中的作用机制,结果显示FMNL2与结直肠的癌侵袭、转移呈正相关。FMNL2通过RhoA/ROCK信号通路促进结直肠癌细胞的运动及侵袭。FMNL2是否与结直肠癌EMT有关?文献报道RhoA是参与肿瘤EMT的一个重要调控因子。结直肠癌细胞干扰FMNL2后,其形态发生改变,由梭形、类似于成纤维细胞的形态变成典型的圆形或卵圆形,该形态的变化有可能是由间质-上皮转化(MET)引起。FMNL2干扰前后的基因芯片结果显示多个与EMT相关的分子(如Paxillin、MAPK、AKT、PI3K等)的表达发生了显著变化,主要涉及了PI3K-AKT和Ras-MEK-MAPK两种途径。由此我们推测:FMNL2可能在结直肠癌EMT中发挥重要作用。本研究重点探讨FMNL2基因与结直肠癌EMT的关系及其参与的信号通路,旨在揭示FMNL2参与结直肠癌转移的新途径,增加对FMNL2这个功能未知基因的新认识,为肿瘤转移机制的研究提供新线索。方法1.FMNL2和EMT标志物在结直肠癌组织及细胞株中的表达及其相关性应用免疫组化S-P法,检测4种转移能力不同的结直肠癌细胞株(SW620、SW480/M5、SW480、HT29)、138例结直肠癌和相应的30例正常结直肠黏膜组织中FMNL2、EMT上皮标记物(E-cadherin、CK)与间质标记物(Vimentin)蛋白的表达情况,分析其相关性。应用荧光定量RT-PCR,分别检测FMNL2、EMT上皮标志物(E-cadherin)与间质标志物(Vimentin)mRNA在4种转移能力不同的结直肠癌细胞株(SW620、SW480/M5、SW480、HT29)中的表达情况。2.FMNL2沉默对结直肠癌细胞EMT的影响利用已构建的FMNL2干扰载体,通过G418筛选获得FMNL2干扰抗性单克隆,并对其进行扩大培养,再用荧光定量RT-PCR检测稳定干扰的效果。应用荧光定量RT-PCR和Western blot检测FMNL2沉默后,EMT上皮标记物(E-cadherin、α-catenin、γ-catenin),间质标记物(Vimentin、Nβ-cateinin)和转录因子(Snail、Slug)的变化。3.FMNL2沉默对TGF-β1诱导的结直肠癌细胞EMT的影响利用外源性TGF-β1诱导结直肠癌细胞株(M5/mock、M5/FMNL2-)及犬肾上皮MDCK细胞株(该细胞株通用于EMT的研究)发生EMT变化,观察其形态学改变,运用荧光定量RT-PCR检测FMNL2、E-Cadherin和Vimentin的mRNA变化;利用Western blot检测EMT上皮标记物(E-cadherin、α-catenin、γ-catenin),间质标记物(Vimentin、Nβ-catenin)和转录因子(Snail、Slug)的表达变化。4.FMNL2参与结直肠癌EMT的可能信号通路运用荧光定量PCR对芯片中一些靶点进FMNL2干扰前后进行检测,验证基因芯片的可靠性。利用Western Blot检测FMNL2沉默后结直肠癌细胞中EMT相关信号蛋白PI3K、AKT、MAPK、MEK以及对应的磷酸化蛋白P-PI3K、P-AKT、P-MAPK、P-MEK的表达变化。结果1.FMNL2和EMT标志物在结直肠癌组织及细胞株中的表达及其相关性在高转移能力的结直肠癌细胞株SW620和SW480/M5中,FMNL2和间质标志物(Vimentin)的表达高于低转移能力细胞株SW480和HT29;而EMT上皮标志物(E-cadherin和CK)的表达低于SW480和HT29。FMNL2、Vimentin在结直肠癌中的表达明显高于正常粘膜组织,淋巴结转移癌中的表达高于结直肠癌组织(P＜0.05),而上皮标志物E-cadherin、CK在正常粘膜中的表达显著高于结直肠癌及淋巴结组织(P＜0.05)。通过相关性统计学分析,发现FMNL2与E-cadherin、CK呈负相关(r=-0.377;P=0.000;r=-0.327,P=0.000),而与间质标记物Vimentin表达呈正相关(r=0.503,P=0.000)。以上结果提示FMNL2与结直肠癌EMT相关,可能通过EMT促进结直肠癌细胞转移。2.FMNL2沉默对结直肠癌细胞EMT的影响FMNL2的干扰效率达75%以上。FMNL2沉默后,结直肠癌细胞形态学发生了改变,由梭形、类似于成纤维细胞的形态变成的典型的圆形或卵圆形;EMT上皮标记物E-cadherin、α-catenin、γ-catenin表达上调,而间质标记物Vimentin和Nβ-catenin表达下调,转录因子Snail和Slug表达量均下调。以上结果提示外源性的FMNL2能促使结直肠癌细胞发生EMT。3.FMNL2沉默对TGF-β1诱导的结直肠癌细胞EMT的影响利用外源性TGF-β1刺激结直肠癌细胞株(M5/mock、M5/FMNL2-)及犬肾上皮MDCK细胞株48小时左右,三种细胞形态学均发生明显的改变。MDCK由圆形、卵圆形变成梭形、成纤维细胞样的间质细胞,出现典型的EMT改变。常规培养时M5/mock细胞多呈梭形、类似成纤维细胞,而M5/FMNL2-细胞多呈圆形、卵圆形的上皮样细胞;TGF-β1刺激后,M5/mock细胞几乎都变成间质样的细胞,而M5/FMNL2-细胞部分转变成间质样的细胞,还可见一定数量的上皮样细胞,相对于M5/mock细胞,M5/FMNL2-细胞转化成梭形、间质样的细胞数量明显减少。荧光定量PCR结果显示,TGF-β1刺激后,三种细胞的上皮标记物E-cadherin的表达均下调,而间质标记物Vimentin的表达上调,FMNL2的表达也有不同程度的上调;M5/mock细胞中E-cadherin和Vimentin的表达变化强于M5/FMNL2-细胞。Western blot结果显示三种细胞TGF-β1刺激之后上皮标记物E-Cadherin、α-Catenin和γ-Catenin表达均下调,间质标记物Vimentin和Nβ-catenin表达均上调,转录因子Snail和Slug表达量均上调;M5/mock细胞中所检测蛋白的表达变化强于M5/FMNL2-细胞。以上结果提示FMNL2能促进结直肠癌细胞发生EMT。4 FMNL2对结直肠癌细胞中EMT相关信号通路中的调控作用荧光定量PCR验证了芯片结果的可靠性。FMNL2沉默后EMT相关信号分子PI3K、AKT、MAPK、MEK、P-PI3K、P-AKT、P-MAPK、P-MEK蛋白表的达均下调,提示FMNL2可能是通过PI3K-AKT和Ras-MEK-MAPK两条信号通路促进结直肠癌细胞发生EMT。结论1.转移相关基因FMNL2与结直肠癌EMT相关;2.转移相关基因FMNL2可能通过PI3K-AKT和Ras-MEK-MAPK两条通路促进结直肠癌细胞发生EMT。本研究的创新之处:1.首次提出FMNL2通过EMT参与结直肠癌转移的新观点;2.为结直肠癌转移机制的研究提供了新的研究靶标。