论文部分内容阅读
4-氨基吡啶体内致痫动物模型海马区Cx32、Cx36和Cx43表达变化目的：观察4-氨基吡啶(4-aminopyridine,4-AP)诱发大鼠痫性发作后海马区缝隙连接蛋白32(Connexin32,Cx32)、缝隙连接蛋白36(Connexin36, Cx36)、缝隙连接蛋白43(Connexin43, Cx43)的mRNA和蛋白表达变化,探讨缝隙连接与痫性发作的关系。方法：55只成年雄性S-D大鼠(体重200-230g),随机分为对照组和实验组。对照组腹腔注射等量无菌生理盐水,实验组采用腹腔注射小剂量4-AP诱发痫性发作。实验组又分为电极组,2h,8h,24h,48h五个亚组。观察各实验组大鼠致痫后的行为学变化并记录全面性强直-阵挛发作(generalized tonic-clonic seizure, GTCS)的潜伏期；采用脑电图记录电极组大鼠致痫后的脑电信号变化；应用免疫组织化学染色方法和Western blot方法测定各组大鼠海马区Cx32. Cx36和Cx43蛋白的表达变化；采用RT-PCR方法测定各组大鼠海马区Cx32. Cx36和Cx43mRNA的表达变化。结果：1.行为学和脑电图结果：实验组造模成功率为88.9%,大鼠出现GTCS的平均潜伏期为32.2±4.8min。脑电图显示致痫后大鼠出现多种形式的痫性放电,包括尖波、棘波和尖慢波。2.免疫组织化学染色结果显示Cx32、Cx36和Cx43广泛分布在大鼠脑组织中。实验组大鼠海马CA3区Cx32、Cx36和Cx43免疫阳性细胞数在致痫后2h较对照组升高(P<0.05)。其中Cx32免疫阳性细胞数在致痫后8h达到峰值(P<0.05),后逐渐下降,直到致痫后48h仍高于对照组(P<0.05)；Cx36和Cx43免疫阳性细胞数在致痫后24h达到峰值(P<0.05)。3. Western blot结果显示实验组大鼠海马区Cx32、Cx36和Cx43蛋白表达在致痫后2h较对照组升高(P<0.05)。其中Cx32蛋白在致痫后8h的表达达到峰值(P<0.05),后逐渐下降,直到致痫后48h仍高于对照组(P<0.05)；Cx36和Cx43蛋白表达在致痫后24h达到峰值(P<0.05)。4. RT-PCR结果显示实验组大鼠海马区Cx32、Cx36和Cx43的mRNA表达在致痫后2h较对照组升高(P<0.05)。其中Cx32mRNA在致痫后8h的表达达到峰值(P<0.05),后逐渐下降,直到致痫后48h仍高于对照组(P<0.05)；Cx36和Cx43mRNA的表达在致痫后8h达到峰值并一直持续保持高表达状态(P<0.05)。结论：4-AP诱发大鼠痫性发作后,海马区Cx32、Cx36、Cx43的基因和蛋白表达上调,这三者可能参与了痫性发作过程。缝隙连接阻滞剂在体外脑片上的抗痫作用机制研究目的：探讨缝隙连接阻滞剂生胃酮(carbenoxolone, CBX)和Cx36阻滞剂奎宁对海马脑片CA3区神经元癫痫样放电的影响及可能机制。方法：脱颈椎法分离雄性S-D大鼠(体重50-100g)脑组织,制备300μm厚度的海马脑片。采用全细胞盲法膜片钳电流钳模式记录CBX和奎宁对荷包牡丹碱(bicuculline, BMI)及高K+诱发的海马脑片CA3区神经元动作电位的影响。应用高频电刺激海马脑片CA3区神经元诱发长时程增强效应(long-term potentiation, LTP)模拟痫性放电过程,采用电压钳模式记录奎宁对谷氨酸介导的长时程增强效应(LTPGlu)的影响。结果：1.CBX抑制BMI和高K+诱发的海马脑片CA3区神经元癫痫样放电：CBX干预后BMI诱发的海马CA3区神经元每分钟发作间期样放电次数明显下降(从12.5±3.3到5.7±1.4/min,n=8)(P<0.05),洗脱CBX后神经元每分钟发作间期样放电次数(8.3±2.7/min)部分恢复；CBX干预后高K+诱发的神经元每分钟发作间期样放电次数明显下降(从18.3±3.6到7.9±2.7/min, n=8)(P<0.05),而洗脱CBX后神经元每分钟发作间期样放电次数(15.8±3.3/min)基本恢复。2.奎宁抑制BMI和高K+诱发的海马脑片CA3区神经元癫痫样放电：奎宁干预后BMI诱发的海马CA3区神经元每分钟发作间期样放电次数明显下降(从7.2±1.6到2.35±1.2/min, n=8)(P<0.05),洗脱奎宁后神经元每分钟发作间期样放电次数(5.5±1.8/min)部分恢复；奎宁干预后高K+诱发的神经元每分钟发作间期样放电次数明显下降(从27.4±4.1到13.8±2.6/min, n=8)(P<0.05),而活脱奎宁后神经元每分钟发作间期样放电次数(25.8±3.7/min)基本恢复。3.正常海马脑片CA3区神经元在反复高频电刺激后能够诱发LTPGlu,而奎宁干预后海马CA3区神经元LTPGIu在反复高频电刺激后不能被诱发。结论：1.CBX和奎宁抑制BMI和高K+诱发的海马脑片CA3区神经元的癫痫样放电活动,并且CBX和奎宁对BMI诱发的痫性电活动的抑制作用更持久。2.奎宁可能通过阻断Cx36介导谷氨酸递质释放减少而发挥抗癫痫作用。