细胞是生命组成的最小单位,对复杂生命体的认识往往从细胞开始,了解细胞内的生命活动可以帮助人们理解人类自身的生命活动。由于衍射极限的存在,传统的光学显微方法已经无法满足生物学研究的需求,在此要求下,科学家们已经提出了许多的突破分辨率极限的超分辨成像方法,将分辨率提高到了纳米量级。空间分辨率与时间分辨率是相互制约的,较高的空间分辨率往往需要耗费更多的时间。而要实现细胞内多分子追踪成像,就要求在具有较高的空间分辨率的同时能够快速的探测到分子的动态过程。单分子追踪方法就满足了这个要求,它能够同时追踪细胞内多个分子,为细胞内生物分子的研究提供了一个非常好的光学工具。近年来,各种单分子定位方法层出不迭,都实现了在一定深度范围内的三维定位,但就整个细胞厚度来说,它们的景深是远远不够的。要想获得完整活细胞范围内的动态信息,就需要将单分子追踪方法与景深拓展方法相结合。本论文基于此背景,提出了一种具有景深拓展能力的变形光栅与具有三维定位能力的双物镜双焦面法相结合,实现了整个细胞范围内的三维定位追踪,可以同时追踪细胞内多个分子。本论文主要工作如下:1.设计了基于双焦面法的三维纳米定位追踪系统。双焦面法的基本原理是通过两个焦平面错位的探测光路进行成像,获得两幅不同离焦量的图像,离焦的分子图像是呈高斯分布的亮环,亮环的强度随着分子的离焦量而变化,可以利用两幅图像的这个变化来获得三维定位。本论文用matlab对双焦面法成像系统进行了模拟,将获得的模拟图像根据双焦面法的定位算法进行了定位分析,在横向和轴向上分别获得了5nm、20nm左右的定位精度。2.设计优化了具有景深拓展能力的变形光栅,并搭建了具有变形光栅的大景深三维纳米定位追踪系统。双焦面法能够在2微米左右的范围内实现轴向定位,对于细胞研究这个深度是不够的,因此需要将双焦面法与拓展景深的方法相结合。变形光栅实质上是一个离轴的菲涅尔波带片,能够将三个不同焦平面的不同衍射级同时成像在同一个像平面上。本论文模拟了变形光栅的成像方式,结合系统参数优化了变形光栅,验证了在一般细胞厚度内（10微米）进行三维纳米定位追踪的可行性。3.理论上比较了本论文提出的方法与传统双焦面法以及变形光栅结合单物镜双焦面法的三维定位能力。利用双物镜实现双探测通道,获取了双焦面法所需的源图像,结合一维变形光栅可以实现6个焦平面的同时成像。此外,由于荧光是从各个方向辐射的,单物镜只能收集到一半的荧光,利用双物镜实现双探测通道的同时,提高了光子利用率,也弥补了由于变形光栅分光造成的光子损失。在理论上比较了本论文所提出的方法与传统双焦面法、变形光栅结合单物镜双焦面法的三位定位能力。本论文的创新点是,提出了一种大景深的三维纳米定位追踪方法,采用变形光栅的多个焦面并行成像和双焦面三维纳米定位方法相结合,既突破了现有光学显微系统的景深,同时也在细胞的厚度内定位和追踪多个运动目标。另外,变形光栅的分光能力会导致每一个层面上光子数的下降,从而影响到系统的定位精度。对于这一点,考虑到一般的单物镜收集到的光子数实际上只有全部光子数目的一半,因此本论文采用了双物镜的方式来弥补这一不足,充分的利用了荧光信号。