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实验一 针康法对脑缺血大鼠运动功能及神经元凋亡的影响目的:观察针康法对脑缺血大鼠运动功能、神经元凋亡的影响,以及cIAP1表达与神经元存活的关系。方法:选取SPF级成年雄性Sprague-Dawley大鼠90只,采用随机数字表法随机分为假手术组、模型组、针刺组、康复组及针康组,每组18只,再按术后3d、7d、14d分成三个亚组,每组6只。除假手术组外所有大鼠均给予永久性大脑中动脉闭塞（pMCAO）手术造模。假手术组与模型组大鼠不进行任何治疗,针刺组大鼠给予头针治疗,康复组大鼠给予跑台训练,针康组大鼠给予头针结合跑台训练。采用前肢抓握力量测试、平衡运动转棒仪（Rota-rod）测试评定大鼠运动功能,Nissl染色观察缺血半暗区神经元损伤,TUNEL-NeuN免疫荧光双染共定位技术观察脑缺血半暗区细胞凋亡及神经元凋亡情况,cIAP1-NeuN免疫荧光双染共定位技术观察脑缺血半暗区cIAP1、NeuN荧光表达,神经元存活及cIAP1和NeuN共表达情况,分析cIAP1与NeuN荧光强度间和cIAP1-NeuN与NeuN-DAPI共定位细胞数量间的相关性。结果:1.前肢抓握力量测试:术后各时间点,与模型组比较,各治疗组大鼠抓握力量均明显增加（P<0.05）。术后7d、14d,与针刺、康复组比较,针康组大鼠抓握力量进一步增加（P<0.05）。2.Rota-rod测试:术后各时间点,与模型组比较,各治疗组大鼠在转棒上的停留时间均明显延长（P<0.05）。术后7d、14d,与针刺、康复组比较,针康组的停留时间进一步延长（P<0.05）。3.Nissl染色:术后3d,模型组右侧脑组织皮质神经细胞数量减少,细胞结构破坏明显,正常神经元细胞少见,胞体萎缩,尼氏体数量明显减少,溶解现象明显;术后7d,神经细胞紧缩,胞浆深染,尼氏小体数量增加,可见部分神经元核周的尼氏小体增加,神经元损伤逐渐恢复;术后14d,仍可见神经细胞紧缩,尼氏小体数量进一步增加,胞浆染色加深,少数神经元核周尼氏小体丰富,形态结构进一步恢复。各时间点上各治疗组神经细胞数量增加,形态结构改善,胞体萎缩有所缓解,尼氏小体数量增加,胞浆深染呈斑片状,随着治疗时间的延长,正常神经元细胞数量增加,且以针康组的改善最为显著。4.细胞凋亡:术后各时间点,与模型组比较,各治疗组细胞凋亡（TUNEL-DAPI共定位细胞）数量均明显减少（P<0.05）;与针刺、康复组比较,针康组细胞凋亡数量进一步减少（P<0.05）。5.神经元凋亡:术后各时间点,与模型组比较,各治疗组神经元凋亡（TUNEL-NeuN共定位细胞）数量均减少（P<0.05）;与针刺、康复组比较,针康组神经元凋亡数量进一步减少（P<0.05）。6.cIAP1荧光强度:术后各时间点,与模型组比较,各治疗组cIAP1荧光强度均升高（P<0.05）;与针刺组比较,针康组cIAP1荧光强度进一步升高（P<0.05）。术后7d、14d,与康复组比较,针康组cIAP1荧光强度进一步升高（P<0.05）。术后7d,与康复组比较,针刺组cIAP1荧光强度进一步升高（P<0.05）。7.NeuN荧光强度:术后各时间点,与模型组比较,各治疗组NeuN荧光强度均升高（P<0.05）;与针刺、康复组比较,针康组NeuN荧光强度进一步升高（P<0.05）。术后7d,与针刺组比较,康复组NeuN荧光强度进一步升高（P<0.05）。术后14d,与康复组比较,针刺组NeuN荧光强度进一步升高（P<0.05）。8.存活神经元:术后各时间点,与假手术组比较,模型组存活神经元（NeuN-DAPI共定位细胞）明显减少（P<0.05）;与模型组比较,各治疗组存活神经元均增加（P<0.05）;与针刺、康复组比较,针康组存活神经元进一步增加（P<0.05）。9.cIAP1与NeuN共表达:术后各时间点,与假手术组比较,模型组cIAP1-NeuN共定位细胞明显减少（P<0.05）;与模型组比较,各治疗组cIAP1-NeuN共定位细胞均增加（P<0.05）;与针刺、康复组比较,针康组cIAP1-NeuN共定位细胞进一步增加（P<0.05）。10.cIAP1与NeuN荧光强度相关性分析:术后各时间点,假手术组和模型组的cI AP1与NeuN荧光强度的Pearson分析显示:缺血条件下,cIAP1与NeuN的荧光强度呈现极强线性正相关（P<0.0001）;模型组和治疗组的cIAP1与NeuN荧光强度的Pearson分析显示:干预条件下,cIAP1与NeuN的荧光强度呈现极强线性正相关（P<0.0001）。11.cIAP 1-NeuN与NeuN-DAPI共定位细胞相关性分析:术后各时间点,假手术组和模型组的cIAP1-NeuN与NeuN-D API共定位细胞的Pearson分析显示:缺血条件下,cIAP1-NeuN与NeuN-DAPI共定位细胞数量呈现极强线性正相关（P<0.0001）;模型组和治疗组的cIAP1-NeuN与NeuN-DAPI共定位细胞的Pearson分析显示:干预条件下,cIAP1-NeuN与NeuN-D API共定位细胞数量呈现极强线性正相关（P<0.0001）。结论:1.针康法可以增加脑缺血大鼠前肢抓握力量,提高运动协调能力,促进运动功能重建,优于单一的针刺和康复治疗;2.针康法可以降低脑缺血大鼠缺血半暗区神经元凋亡,减少细胞凋亡数量,发挥神经保护作用;3.神经元上cIAP1表达与神经元存活密切相关,脑缺血后cIAP1表达下调,存活神经元减少,针康法干预后cIAP1表达上调,存活神经元增加。实验二 cIAP1在针康法降低脑缺血大鼠神经元凋亡中的作用机制目的:构建针对cIAP1基因的慢病毒shRNA表达载体,探讨cIAP1在针康法降低脑缺血大鼠神经元凋亡中的作用机制。方法:将3条针对cIAP1的shRNA和1条阴性对照序列转染至SH-SY5Y细胞,建立cIAP1 shRNA稳定表达的SH-SY5Y细胞系。设立未转染组（Control）、阴性对照转染组（shRNA NC 组）、shRNA-1转染组、shRNA-2转染组、shRNA-3转染组。采用 Real-time PCR 和 Western blotting 技术检测 3 条 cIAP1 shRNA在mRNA和蛋白水平上的干扰效率,筛选干扰效率最高的cIAP1 shRNA构建针对cIAP1基因的慢病毒shRNA表达载体。选取SPF级成年雄性Sprague-Dawley大鼠180只,采用随机数字表法随机分为假手术组、模型组、针康组、针康+Lv-cIAP1 NC组及针康+Lv-cIAP1组,每组36只,再按术后3d、7d、14d分成三个亚组,每组12只。除假手术组外所有大鼠均给予永久性大脑中动脉闭塞（pMCAO）手术造模,针康+Lv-cIAP1 NC组和针康+Lv-cIAP1组在进行pMCAO造模前30 min内分别侧脑室注射Lv-cIAP1 NC和Lv-cIAP1慢病毒干扰载体。假手术组与模型组大鼠不进行任何治疗,其余三组大鼠给予针康法治疗。采用Western blot检测各实验组 cIAP1、cleaved caspase-9、cleaved caspase-8、cleaved caspase-3、NeuN蛋白表达,采用TUNEL-NeuN免疫荧光双染共定位技术观察脑缺血半暗区细胞凋亡及神经元凋亡情况。结果:1.cIAP1 mRNA:与 Control 组比较,shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3 组SH-SY5Y 细胞上 cIAP1 mRNA 表达分别下调 28.76%、71.91%、10.37%（P<0.05）,其中以shRNA-2干扰效率最高。2.cIAP1 蛋白:与 Control 组比较,shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3 组SH-SY5Y 细胞上 cIAP1 蛋白表达分别下调 46.89%、74.43%、38.03%（P<0.05）,其中以ShRNA-2干扰效率最高。3.cIAP1蛋白表达:术后各时间点,与假手术组比较,模型组cIAP1表达降低（P<0.05）;与模型组比较,针康组cIAP1表达升高（P<0.05）;与针康组比较,针康+Lv-cIAP1组cIAP1表达降低（P0.05）。4.cleaved caspase-9蛋白表达:术后各时间点,与假手术组比较,模型组cleaved caspase-9表达升高（P<0.05）;与模型组比较,针康组cleaved caspase-9表达降低（P<0.05）;与针康组比较,针康+Lv-cIAP 1组cleaved caspase-9 表达升高（P0.05）。5.cleaved caspase-8蛋白表达:术后各时间点,与假手术组比较,模型组cleaved caspase-8表达升高（P<0.05）;与模型组比较,针康组cleaved caspase-8表达降低（P<0.05）;与针康组比较,针康+Lv-cIAP1组cleaved caspase-8 表达升高（P0.05）。6.cleaved caspase-3蛋白表达:术后各时间点,与假手术组比较,模型组cleaved caspase-3表达升高（P<0.05）;与模型组比较,针康组cleaved caspase-3表达降低（P<0.05）;与针康组比较,针康+Lv-cIAP 1组cleaved caspase-3 表达升高（P0.05）。7.NeuN蛋白表达:术后各时间点,与假手术组比较,模型组NeuN表达降低（P<0.05）;与模型组比较,针康组NeuN表达升高（P<0.05）;与针康组比较,针康+Lv-cIAP 1组NeuN表达降低（P0.05）。8.细胞凋亡:术后各时间点,与假手术组比较,模型组大鼠细胞凋亡（TUNEL-DAPI共定位细胞）数量明显增加（P<0.05）;与模型组比较,针康组细胞凋亡数量明显减少（P<0.05）;与针康组比较,针康+Lv-cIAP1组细胞凋亡数量增加（P0.05）。9.神经元凋亡:术后各时间点,与假手术组比较,模型组大鼠神经元凋亡（TUNEL-NeuN共定位细胞）数量明显增加（P<0.05）;与模型组比较,针康组神经元凋亡数量明显减少（P<0.05）;与针康组比较,针康+Lv-cIAP1组神经元凋亡数量增加（P0.05）。结论:针康法通过调节cIAP1表达,抑制caspase-9、caspase-8和caspase-3活化,降低脑缺血大鼠缺血半暗区神经元凋亡,减少细胞凋亡数量。