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研究目的帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种与环境毒物暴露密切相关的神经系统退行性疾病。国内外研究发现,长期接触农药等环境毒物能促进PD的发生发展。百草枯(paraquat,PQ)和代森锰(maneb,Mb)是两种常用的农药,均被证明与PD发生相关。流行病学调查发现,PQ和Mb联合应用明显增加PD发病风险。实验动物暴露PQ和Mb也观察到多巴胺能神经元损伤以及步态异常等类似PD的病理改变和临床症状。目前,PQ和Mb联合染毒已成为构建PD动物模型的公认方法。近来发现,PQ和Mb联合暴露诱导的PD动物模型不仅出现运动症状,还出现焦虑、抑郁以及学习、记忆障碍等多种非运动症状(Non-motor symptoms,NMS),但NMS发生机制不清。蓝斑核(Locus ceruleus,LC)是位于第四脑室侧缘的头端菱形脑上部的一群密集的产生去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)的神经元群,通过在其投射脑区释放NE神经递质,参与多种全身活动的调节,例如感觉、情绪调节、维持觉醒状态和学习记忆等。PD患者大脑检测发现,LC/NE神经元也存在变性,其程度甚至比黑质多巴胺能神经元严重,出现时间也更早。我们近期研究也发现,PQ和Mb联合暴露造成小鼠LC/NE神经元丢失,大脑NE含量明显降低。然而,LC/NE受损及NE含量降低是否与PQ和Mb联合暴露引起的NMS有关?如果有关,其分子机制又是什么?均未见报道。因此,在本研究中,我们使用了针对LC/NE神经元的特异性毒物N-(2-chloroethyl)-N-ethyl-2-bromobenzylamine(DSP4)诱导小鼠 LC/NE神经元损伤和NE神经递质缺失,在此基础上再用PQ和Mb来制备PD模型,观察小鼠步态、便秘、抑郁和学习、记忆行为的改变,同时检测不同脑区神经损伤情况以及神经炎症反应,以期为阐明LC NE在PQ和Mb诱导PD NMS中的作用提供证据。研究方法80只成年SPF级雄性C57BL/6J小鼠,适应性喂养7天后,按体重随机分为对照组(Con)、模型组(PQ+Mb)、DSP4处理组(DSP4+PQ+Mb)和单独DSP-4组(DSP4-alone),每组20只。百草枯(PQ)与代森锰(Mb)分别按照10 mg/kg.bw、30 mg/kg.bw剂量对模型组和DSP-4处理组小鼠进行腹腔注射染毒,2次/周,连续4周,建立PD小鼠模型。DSP-4处理组小鼠在PQ+Mb染毒前一周,腹腔注射一次DSP-4,剂量为50 mg/kg.bw。对照组和单独DSP-4组分别给予同等剂量的0.9%生理盐水和DSP-4。染毒结束后分别利用步态测量、粪便收集、强迫游泳和水迷宫实验记录小鼠的运动功能、便秘、抑郁和学习、记忆能力。行为学测量结束后,麻醉小鼠,部分小鼠(n=5只/组)心脏灌注生理盐水5分钟,再经4%多聚甲醛灌注10分钟,收集大脑,冰冻切片后,进行免疫组化染色,观察多巴胺神经元(TH)、海马和皮质神经元(NeuN)数量以及神经突触(PSD95)损伤、小胶质细胞(Iba-1)活化水平的变化。其余小鼠(n=15只/组)经生理盐水心脏灌注后,冰上迅速剥离大脑并分离中脑、纹状体、脑干、海马和皮质脑区,放入液氮速冻后转入-80℃保存。分别利用Western Blot方法检测NeuN、PSD95、Iba-1蛋白表达的变化;利用qRT-PCR检测小胶质细胞M1/M2极化标记物的mRNA水平。选用Prism5.0统计分析软件,对实验结果进行统计学分析。结果1.DSP-4对不同脑区NE含量的影响 与Con相比,小鼠在注射DSP-4后1天,中脑、海马和皮质脑区NE含量明显下降,在DSP-4注射后28天分别下降48.8%,72.2%和45.5%,差异有统计学意义(p<0.05)。2.NE缺失对PQ+Mb暴露小鼠体重的影响 与Con相比,PQ+Mb组小鼠体重无明显变化,但DSP4+PQ+Mb组小鼠体重明显下降,与Con组和PQ+Mb组相比差异均具有统计学意义(p<0.01)。3.NE缺失对PQ+Mb暴露小鼠便秘样行为的影响粪便收集实验中,PQ+Mb组和DSP-4+PQ+Mb组小鼠排便次数明显低于Con组(p<0.05),但PQ+Mb组和DSP-4+PQ+Mb组无明显差异(p>0.05);粪便干湿比结果显示,各组小鼠粪便干湿比无明显差异(p>0.05)。4.NE缺失对PQ+Mb暴露小鼠抑郁样行为的影响强迫游泳实验中,PQ+Mb组和DSP-4+PQ+Mb组小鼠在水中挣扎时间与Con组相比无明显差异(p>0.05),PQ+Mb组和DSP-4+PQ+Mb组相比无明显差异(p>0.05);游泳挣扎次数结果显示,各组小鼠无明显差异(p>0.05)。5.NE缺失对PQ+Mb暴露小鼠学习、记忆的影响定位航行实验中,与Con组相比,PQ+Mb组小鼠躲避时间、游泳路程无明显改变(p>0.05),DSP-4+PQ+Mb组小鼠呈明显上升趋势,差异有统计学意义(p<0.01);与PQ+Mb组相比,DSP-4+PQ+Mb组小鼠的躲避时间、游泳路程也增多,差异有统计学意义(p<0.05)。空间探索结果显示,与Con组相比,PQ+Mb组小鼠首次穿越平台时间、穿越次数和目标象限时间百分比无明显改变(p>0.05),DSP-4+PQ+Mb组小鼠首次穿越平台时间和穿越次数明显增大,目标象限时间百分比显著降低,差异有统计学意义(p<0.05)。6.NE缺失对PQ+Mb暴露小鼠多巴胺能神经系统的影响免疫组化染色显示,与Con相比,PQ+Mb组小鼠黑质区多巴胺能神经元(TH+细胞)数量下降,差异有统计学意义(p<0.05);与PQ+Mb组相比,DSP-4+PQ+Mb组小鼠黑质区多巴胺能神经元数量进一步下降,差异具有统计学意义(p<0.01)。纹状体区TH染色光密度分析显示,DSP-4注射后PQ+Mb组小鼠纹状体区TH染色光密度明显降低,差异具有统计学意义(p<0.01),说明DSP-4加剧了 PQ+Mb小鼠多巴胺能神经元轴突损伤。海马和皮质脑区TH染色发现,与Con组相比,PQ+Mb组小鼠海马和皮质脑区TH染色光密度无明显变化;与Con和PQ+Mb组相比,DSP-4+PQ+Mb组海马和皮质脑区TH染色光密度进一步下降,差异有统计学差异(p<0.05)。小鼠单独注射DSP-4对多巴胺能神经元数量和轴突均无明显影响。Western blot结果显示,与Con组相比,PQ+Mb组小鼠海马和皮质脑区TH蛋白表达明显降低(p<0.01);与PQ+Mb组相比,DSP-4+PQ+Mb组海马和皮质脑区TH蛋白表达进一步下降,差异有统计学差异(p<0.01)。7.NE缺失对PQ+Mb暴露小鼠海马区神经损伤的影响免疫组化结果显示,PQ+Mb组小鼠海马区Neu-N+神经元数量和突触蛋白PSD-95表达较Con组比较无明显变化,而DSP-4+PQ+Mb组小鼠海马区的Neu-N+神经元数量和突触蛋白PSD-95表达较Con和PQ+Mb组比较明显下降,差异有统计学意义(p<0.01)。Western blot结果与免疫组化结果一致,PQ+Mb组小鼠海马区Neu-N和PSD-95蛋白表达较Con组比较无明显变化(p>0.05);与Con和PQ+Mb组相比,DSP-4+PQ+Mb组小鼠海马区Neu-N和PSD-95蛋白表达明显减少,差异有统计学意义(p<0.05)。说明DSP-4加剧了 PQ+Mb小鼠海马区神经元和神经突触损伤。8.NE缺失对PQ+Mb暴露小鼠皮质区神经损伤的影响免疫组化结果显示,PQ+Mb组小鼠皮质区Neu-N+神经元数量和突触蛋白PSD-95表达较Con组比较无明显变化,而DSP-4+PQ+Mb组小鼠皮质区的Neu-N+神经元数量和突触蛋白PSD-95表达较Con和PQ+Mb组比较明显下降,差异有统计学意义(p<0.05)。Western blot结果与免疫组化结果一致,PQ+Mb组小鼠皮质区Neu-N和PSD-95蛋白表达较Con组比较无明显变化(p>0.05);与Con和PQ+Mb组相比,DSP-4+PQ+Mb组小鼠皮质区Neu-N和PSD-95蛋白表达明显减少,差异有统计学意义(p<0.05)。说明DSP-4加剧了 PQ+Mb小鼠皮质区神经元和神经突触损伤。9.NE缺失对PQ+Mb暴露小鼠神经炎症水平的影响免疫组化结果显示,PQ+Mb组小鼠海马、皮质区小胶质细胞活化数目和Iba-1的表达较Con组存在上升趋势,DSP-4+PQ+Mb组小鼠海马和皮质区小胶质细胞数目和Iba-1蛋白表达较Con和PQ+Mb组显著增多,差异有统计学意义(p<0.01)。Western blot结果与免疫组化结果趋势一致,PQ+Mb组小鼠海马、皮质区Iba-1蛋白表达较Con组上升;与Con和PQ+Mb组相比,DSP-4+PQ+Mb组小鼠在海马和皮质区的Iba-1蛋白表达较显著升高,差异有统计学意义(p<0.05)。RT-PCR结果显示,PQ+Mb组小鼠海马区的iNOS,TNF-α和IL-1β水平较Con组上升;与Con和PQ+Mb组相比,DSP-4+PQ+Mb组小鼠的iNOS,TNF-α和IL-1β水平显著上升,差异有统计学意义(p<0.05)。相反,与PQ+Mb组相比,DSP-4+PQ+Mb组小鼠的Ym-1表达显著降低(p<0.05),在Arg-1的表达无明显变化(p>0.05)。结论1.NE缺失对PQ+Mb暴露小鼠便秘和抑郁样行为无明显影响。2.NE缺失加重PQ+Mb暴露小鼠学习、记忆功能障碍。3.NE缺失促进PQ+Mb暴露小鼠多巴胺能神经系统损伤以及海马、皮质神经元退变。4.NE缺失促进PQ+Mb暴露小鼠大脑小胶质细胞活化和M1极化。