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槲皮素与儿茶素是膳食中最为丰富的两种黄酮类成分,具有多种有益人体健康的生物学活性。我们前期研究发现,槲皮素与儿茶素可通过协同抑制螺旋环螺旋结构域扩散激酶（CHUK）基因的转录表达增强Hep G2细胞抗氧化应激的能力,但是两者协调作用的分子机制不清楚。本研究进一步选择大鼠和人胚胎肝细胞HHL-5研究槲皮素和儿茶素在动物肝脏和其他肝细胞中的协同抗氧化应激作用及其分子机制;通过双荧光素酶报告基因实验筛选了CHUK的特异性启动子序列;采用酵母单杂交技术结合双荧光素酶报告实验、生物信息学筛选出调控CHUK的潜在转录因子（TFs）;通过双荧光素酶报告实验、EMSA和Ch IP-PCR实验验证了转录因子FOXO3与CHUK启动子序列的结合,并发现槲皮素与儿茶素可以协同抑制FOXO3与CHUK启动子的结合;采用分子对接模拟和细胞热转移实验,发现槲皮素、儿茶素直接与FOXO3蛋白的相互作用及其作用模式;通过蛋白原核表达,结合基因定点突变,利用紫外-可见吸收光谱、荧光光谱、圆二色谱等体外结合表征方法,明确槲皮素、儿茶素与转录因子蛋白的结合特性、作用位点及协同调控机制,阐明了槲皮素和儿茶素协同抑制CHUK基因转录增强细胞抗氧化应激的分子机制。研究结果为揭示槲皮素与儿茶素抗氧化应激的协同增效机制提供了理论依据,同时为明确膳食中抗氧化成分的生物学功能提供了理论参考。主要研究结果如下:（1）槲皮素和儿茶素在大鼠肝脏、Hep G2和HHL-5细胞中均具有协同抵御乙醇或H2O2诱导的氧化应激损伤的作用。该作用是通过协同激活Keap1/Nrf2和抑制CHUK/p53/Bax信号通路实现的。其中,CHUK在槲皮素和儿茶素协同抗氧化应激中发挥关键作用,槲皮素和儿茶素协同抑制CHUK基因转录增强细胞抗氧化应激能力。（2）调控CHUK的转录因子FOXO3的筛选和验证。构建了CHUK启动子序列（-2000～-1）的不同截短体,通过双荧光素酶报告基因实验,筛选出CHUK的特异性启动子序列（CHUK Pro-500～-1）。构建了人类c DNA文库和诱饵酵母载体菌株,通过酵母单杂交筛库,筛选出8个潜在调控CHUK的转录因子（ETV4、FOXO3、Elk1、TBP、RXRA、YY1、AP1、SP1）。构建了猎物载体p GADT7-TFs,用于酵母单杂交回转验证实验;构建了转录因子过表达载体pc DNA3.1-TFs,用于转染细胞进行双荧光素酶验证实验,结合两个验证实验结果发现,FOXO3可能为调控CHUK的转录因子。通过双荧光素酶报告基因实验、EMSA和Ch IP-PCR实验,进一步明确了FOXO3可以直接结合CHUK启动子序列,结合位点为-TTGTTTCC（-124～-117）。（3）槲皮素与儿茶素通过靶向FOXO3协同抑制转录因子FOXO3与CHUK启动子序列的结合。通过双荧光素酶报告基因和Ch IP-PCR实验发现,槲皮素与儿茶素的加入,分别抑制了FOXO3与CHUK启动子序列的结合,并且二者半剂量联用较单药处理抑制作用更强,体现出协同增效的作用。通过细胞热转移实验发现槲皮素、儿茶素可以分别或共同直接与FOXO3结合,并且槲皮素与儿茶素之间可以协同增强蛋白的热稳定性。通过分子对接模拟发现,槲皮素与儿茶素可能通过共同结合在转录因子FOXO3蛋白DNA结合域（DBD）中不同位点,干扰FOXO3与DNA的结合,从而协同抑制了CHUK的转录表达。（4）槲皮素、儿茶素与转录因子FOXO3的互作关系及靶点确证。通过紫外-可见吸收光谱、荧光光谱、圆二色谱体外表征结合定点突变技术发现,槲皮素、儿茶素与FOXO3蛋白之间存在交互作用,槲皮素、儿茶素对FOXO3蛋白通过静态猝灭促进复合物的形成,交互作用降低了色氨酸微环境的疏水性,使FOXO3蛋白α-螺旋结构显著减少,β-折叠结构显著增加,促进了肽链的舒展,并且该交互作用体现了显著的协同效应。槲皮素、儿茶素与FOXO3相互作用的关键结合位点可能分别是Ser218、Asn237、Asp239、Gly244、Arg248和Leu214、Phe220、Pro247、Arg249。（5）槲皮素与儿茶素通过靶向FOXO3协同抑制CHUK基因转录增强细胞抗氧化应激的分子机制可能是:槲皮素和儿茶素通过共同作用于CHUK转录因子FOXO3的DNA结合域,干扰靶基因DNA的结合,并破坏蛋白-DNA复合物的稳定性,进而协同抑制FOXO3与CHUK启动子序列的结合,抑制CHUK的转录表达,影响CHUK下游基因表达,从而协同增强细胞抗氧化应激作用。