蛋白尿是肾脏疾病病人常见的临床表现，长期以来，蛋白尿在肾脏疾病发生和发展中的重要作用一直没有引起人们的重视。近年来的研究结果显示，大量蛋白尿不仅是肾脏病变严重程度的重要标志，且与肾脏疾病的进展速率密切相关，蛋白尿可能作为预测肾脏疾病进展的独立危险因素，尤其和慢性肾脏疾病肾小管间质病变关系更为密切。众所周知，肾小管间质病变程度直接影响疾病的预后，尤其是肾间质纤维化(tubulointerstitial fibrosis，TIF)是各种人类和实验性肾脏疾病进展至肾功能衰竭的共同途径，在各类慢性肾脏疾病中，肾小管间质病变的程度是判断肾功能恶化的速度及预后的重要指标。 正常人尿中蛋白含量不超过150mg／24小时，在疾病情况下，尿中蛋白的含量显著增多，尿蛋白的组成成分也发生显著改变，且不同病理类型的肾脏疾病患者尿中的蛋白含量和组分也有显著差别，其预后也各不相同。已有的研究表明，尿蛋白对肾脏固有细胞显著的毒性作用，加速肾脏疾病的发生和发展。 目前国内外多数研究均采用血清中提纯的蛋白成分，如白蛋白等进行相关研究，只能部分解释尿蛋白的肾脏损伤机制，不能解释不同病理类型的肾脏疾病患者，即使其蛋白尿的程度相近，肾小管间质的炎症反应及损伤程度却并不相同。因此，有学者认为，炎症细胞化学性趋化因子的上调表达可作为肾小管损伤的重要标志。同时研究还发现丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路的激活参与了尿蛋白介导的肾小管间质炎症和纤维化的发生发展过程，提示MAPK信号通路的激活可能在肾病患者蛋白尿介导的肾脏损伤中起重要作用。 本实验的主要目的就是探讨两种不同病理类型肾病患者尿蛋白刺激人近端肾小管上皮细胞炎症因子上调表达及其分子信号机制。研究内容包括： 1.收集并提纯MCD和FSGS患者24小时尿蛋白，比较两种不同病理类型肾脏疾病患者尿中蛋白组分的差异。 2.比较两种病理类型患者尿蛋白对人近端肾小管上皮细胞炎症细胞化学性趋化因子表达的影响，并与人血清白蛋白比较。 3.MAPK信号通路(主要是p38和ERK)在尿蛋白介导肾小管上皮细胞上调表达炎症细胞化学性趋化因子过程中的活化状态及可能的作用。 材料与方法： 22例2005～2006年间中山大学附属第一医院肾内科的住院患者，所有病人均未开始接受肾上腺皮质激素和(或)免疫抑制剂治疗。经临床和肾活检确定诊断原发性肾小球肾炎的住院病例，其中男19例，女3例，中位数年龄30岁(18～68岁)。冷藏条件下收集患者24小时尿液，低温离心(4000 g×15分钟，4℃)后，去除不溶性杂质。将上清用0.45μm滤膜过滤去除细胞及小颗粒物质。4 C环境下超滤器中进行超滤，去多余的水分及分子量5KD以下的小分子物质，如盐分、尿素、肌酐等，得到纯化浓缩的尿蛋白。纯化的尿蛋白经过过滤除菌和去除内毒素后，并经凝胶沉淀法鲎试验证实尿蛋白内毒素已去除。然后冻干成千粉后，-20 C保存待用。应用SDS—PAGE法观察尿蛋白分子量谱。用无菌PBS溶液溶解成不同浓度刺激细胞，全自动生化分析仪测定样品中尿素氮和肌酐含量，证实尿蛋白中小分子物质已基本去除后，再次过滤除菌备用。应用流式细胞仪CBA法，检测各患者尿蛋白中部分前炎症因子的含量 MTT实验及LDH释放实验观察尿蛋白对小管细胞增殖及损伤的影响。HK-2细胞用含10％FSC的1：IDMEM／F12培养基孵育于37℃，5％CO2的细胞培养箱中。首先检测尿蛋白刺激HK-2细胞表达MIF、RANTES及OPN表达的时效(0至48h)及量效关系(0.1至10.0mg／ml)，以选择合适的尿蛋白刺激浓度和培养时间。整个实验分为尿蛋白刺激组(10例MCD患者与12例FSGS患者尿蛋白分别以相同时间和浓度分别刺激HK-2细胞)、p38MAPK特异性抑制剂(SB203580，10 μmol／L)及ERK特异性抑制剂(PD98059，50 μmol／L)处理组。0.1％DMSO作为对照组。所有细胞收集后检测MIF、RANTES及OPN mRNA及蛋白表达以及磷酸化p38、ERK蛋白水平。应用RT-PCR方法检测mRNA的表达水平，用Western blot、间接免疫荧光、流式细胞仪及ELSA的方法检测蛋白水平的表达。 所有计量资料以均值±标准差表示，根据方差齐性检验结果，两组间比较采用独立样本t检验。多组间均数的比较采用单因素方差分析。所有数据均用SPSS11.0统计软件处理，在统计分析中P<0.05认为差异有统计学意义。 结果： 1、所收集MCD及FSGS患者肾功能及尿蛋白定量均没有显著性差异(p>0.05)，FSGS患者平均年龄大于MCD患者(p<0.05)。 2、SDS—PAGE电泳分析结果显示，MCD患者尿蛋白混合物大多由中分子量蛋白(分子量40～70KD)组成，表现为选择性中分子蛋白尿，而FSGS患者尿蛋白混合物中大分子量蛋白(分子量120～400KD)较MCD患者明显增多，主要表现为非选择性蛋白尿。 3、60mg／ml的尿蛋白中IL-1β、IL-10、TNF及IL-12p70的含量非常低，仅IL-8及IL-6的含量相对较高，但个体差异较大。比较两种尿蛋白，各细胞因子的含量没有统计学差异。 　　4、MTT实验中，白蛋白及尿蛋白刺激HK-2细胞72小时均可显著抑制其增殖，并呈浓度依赖性，且尿蛋白作用更强(p<0.05)，但两种尿蛋白相比其抑制作用无明显差异(p>0.05)。 5、LDH释放法检测尿蛋白的对小管细胞的毒性作用，结果发现5mg／ml尿蛋白对细胞即具有损伤作用(p<0.05)，10mg／ml时则更加明显。但两种尿蛋白比较损伤作用无明显差异(p>0.05)。 6、所有MCD患者及FSGS患者尿蛋白分别刺激HK．2细胞，结果显示两种尿蛋白均呈时间及浓度依赖模式明显上调RANTES、MIF及OPN mRNA的表达(p<0.05)，且FSGS患者尿蛋白的作用似乎更强。 7、选取24小时作为刺激的时间点，相同浓度的HSA及各个MCD、FSGS患者尿蛋白分别刺激HK-2细胞，结果显示两种病人的尿蛋白均可显著刺激肾小管上皮细胞RANTES、MIF及OPNmRNA的上调表达，且与两者相比，FSGS患者尿蛋白更大程度上刺激THK-2细胞内RANTES，MIF mRNA及蛋白水平的增高(p<0.05)，但OPN的表达在两者无明显差异(p>0.05)。人血清白蛋白则对HK-2细胞各趋化因子的表达均无显著的影响(p>0.05)。 8、1mg／mlHSA及所有MCD、FSGS患者尿蛋白分别刺激HK-2细胞，尿蛋白均可呈时间依赖的模式刺激HK-2细胞磷酸化ERK及p38的表达(p<0.05)，而相同浓度的白蛋白对HK-2细胞p38及ERK的活性无明显影响(p>0.05)。 9、p38特异性抑制剂SB203580可显著抑制MCD及FSGS患者尿蛋白介导的HK-2细胞RANTES、MIF和OPN mRNA的上调表达作用(P<0.05)。 10、ERK特异性抑制剂PD98059亦可显著抑制PSGS患者尿蛋白介导的HK-2细胞RANTES、MIF和OPN mRNA的上调表达(p<0.05)。但对MCD患者尿蛋白的刺激作用却仅能抑制其介导的OPN的表达上调(p<0.05)，而对RANTES、MIF的表达上调作用没有明显抑制效应(p>0.05)。 结论： 根据研究结果，我们得出以下结论： 1.MCD患者尿蛋白以中分子量蛋白(40～70KD)为主，主要表现为选择性蛋白尿；而FSGS患者尿蛋白以大中分子量蛋白(40～400KD)为主，主要表现为非选择性蛋白尿，两种尿蛋白组成成分有显著差别。 2.FSGS和MCD患者尿蛋白均可刺激人近端小管上皮细胞上调表达MIF和RANTES，但FSGS尿蛋白的作用更强，提示FSGS患者预后较差可能与此有关。 3.FSGS和MCD患者尿蛋白均可刺激肾小管上皮细胞p38 MAPK的激活，p38 MAPK特异性抑制剂SB203580可显著抑制尿蛋白刺激的HK-2细胞RANTES、MIF和OPN的上调表达，提示p38MAPK在尿蛋白的肾脏损害机制中起重要作用。 4.FSGS和MCD患者尿蛋白均可刺激肾小管上皮细胞ERK的激活，ERK特异性抑制剂PD98059可显著抑制FSGS患者尿蛋白刺激的HK-2细胞RANTES、MIF和OPN的上调表达，而在MCD患者仅抑制OPN的上调表达，提示ERK参与了尿蛋白的部分致炎作用。 5.人血清白蛋白并不刺激肾小管细胞上皮细胞化学性趋化因子的表达，对p38和ERK的活性也无明显影响，提示白蛋白可能不是蛋白尿致肾脏炎症的主要因素。