论文部分内容阅读
缺钙是全球范围内常见的健康问题,且随着社会人口老龄化日趋严重,骨质疏松症也日益成为重要的公共健康问题。本实验前期研究发现鸭蛋蛋清肽（Desalted duck egg white peptides,DPs）及蛋清源四肽VSEE在体内外实验模型中均具有良好的促钙吸收作用,其主要是通过激活TRPV6钙离子通道促进钙吸收的。然而对于钙敏感受体（Calcium sensing receptor,Ca SR）是否是DPs的另一作用靶标,以及DPs和VSEE是否能直接影响骨合成代谢尚不明确。本文采用阴离子交换柱、HPLC-ESI/MS/MS、分子对接虚拟筛选技术和在体小肠单向灌流法（Single-pass intestinal perfusion,SPIP）,考察了Ca SR是否介导DPs对肠钙吸收的调控作用,以期更全面地诠释鸭蛋蛋清肽的促钙吸收机理。此外,本文通过MC3T3-E1细胞和去势大鼠骨质疏松模型,并结合钙离子荧光探针技术、分子生物学手段、Micro CT分析、组织学观察等方法,将DPs促钙吸收研究拓展到促进骨合成研究,并对其相关机理进行了探究。同时,本文采用体外模拟胃肠道消化试验、Caco-2/HT-29共培养模型、药物代谢动力学试验,考察了VSEE的体外稳定性、转运吸收和相关机制,以及药物代谢动力学特征和代谢稳定性,旨在为VSEE未来的应用和开发上提供理论依据。本文主要研究结果如下:1.正构调节钙敏感受体鸭蛋蛋清肽的筛选与鉴定采用阴离子交换柱对DPs进行初步的分离纯化,筛选出具有高可溶性钙结合活性的组分（F3）,并对F3进行HPLC-ESI-MS/MS分析,解析出49条肽段,其中包含16条含有芳香族氨基酸的肽段。采用分子对接虚拟筛选技术对这16条肽段与Ca SR蛋白的亲和力进行预测,根据Total score打分从中选取了FAE、FNE、INSW、FDPE和NFE进行后续实验。在体小肠单向灌流实验结果表明:INSW和NFE能显著降低由NPS-2143引起的甲状旁腺激素（Parathyroid hormone,PTH）水平升高（P<0.05）,抑制率分别为45.80%和48.81%,并能显著提高小肠钙吸收百分比、吸收速率常数（Ka）和有效渗透系数（Peff）,显著上调十二指肠上Ca SR基因表达量（P<0.05）。此外,分子对接结果表明这两条肽段均能很好地进入Ca SR蛋白的活性口袋,并占据活性中心,其主要结合作用力为氢键作用和疏水相互作用,结合位点位于Ca SR蛋白的捕虫夹结构域（Venus flytrap domain,VFTD）,与芳香族氨基酸结合位点类似。2.DPs及VSEE对MC3T3-E1增殖、分化和矿化的影响及相关机制研究DPs（0.8-10mg/m L）和VSEE（0.2-2m M）在含或不含4m M Ca Cl2下分别处理前成骨细胞MC3T3-E15天和7天后发现,细胞增殖率均显著增加,并显著提高MC3T3-E1细胞在S期的比例（P<0.05）。DPs和VSEE在含/不含4m M Ca Cl2下分别处理MC3T3-E1细胞均能显著提高其碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）活性（P<0.05）,促进矿化结节的产生;DPs/VSEE+4m M Ca Cl2组的效果均优于相同浓度但不添加Ca Cl2处理组。此外,DPs、VSEE能显著上调Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白（Wnt3a、LRP5、β-catenin）表达量,以及相关下游蛋白Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2,Runx2）、骨保护素（Osteoprotegerin,OPG）蛋白的表达水平（P<0.05）,继而促进MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化。此外,在[Ca2+]i为2m M时,DPs能激活L-型钙离子通道,对促进MC3T3-E1细胞“外钙内流”有部分贡献;VSEE能诱导MC3T3-E1细胞内钙库中钙离子的释放,同时能激活L-型钙离子通道,且其促进细胞“外钙内流”的能力较DPs大幅提升。VSEE促MC3T3-E1细胞分化、矿化的构效关系研究结果表明,VSEE的酸性氨基酸簇“EE”对于MC3T3-E1细胞分化和矿化有重要的贡献;四肽氮端为“V”对MC3T3-E1分化和矿化的促进作用优于氮端为“A”;VSEE的丝氨酸“S”磷酸化后,其对MC3T3-E1细胞分化和矿化也具有明显的促进作用,但若外源添加钙离子时,则还需考虑钙磷比对骨形成的影响。3.VSEE体内外消化、吸收和代谢研究VSEE分别在37-100℃和p H 4-10下处理后,其含量均能保持在95%以上,VSEE先后经过胃蛋白酶和胰蛋白酶共同作用后,其含量仍能保持在80%以上;提示VSEE具有较高的体外稳定性,同时对消化酶也具有较高的耐受性。在Caco-2/HT-29细胞共培养模型中,VSEE的最优转运条件为转运时间2h和浓度0.5mmol/L,其转运量可达到16.51%;此外,VSEE是通过细胞旁路转运和小肽转运蛋白1（Peptide transporter 1,Pep T1）两种途径转运吸收的。药物代谢动力学研究发现,VSEE的血药浓度经时曲线符合1/C2权重的二室模型,其在大鼠体内的表观分布容积较小（1.17±0.15 L/kg）,但滞留时间（76.05±1.11 min）和半衰期（57.0±0.42 min）较长;提示VSEE脂溶性较差,但具有较好的稳定性,在体内不易被降解。4.鸭蛋蛋清肽对去势大鼠骨质疏松及脂质代谢紊乱的干预作用及机理研究在去势大鼠骨质疏松模型中,DPs和VSEE能显著降低血清中骨转换标志物ALP、I型原胶原N端前肽（N-terminal propeptide of type I procollagen,PINP）、I型胶原羟基端肽β降解产物（Cross-linked C-terminal telopeptide,β-CTX）水平（P<0.05）,显著提高股骨与胫骨干重指数和骨钙含量（P<0.05）;DPs和VSEE也可以有效地改善去势大鼠股骨与胫骨的生物力学性能,减轻骨微结构的破坏,增加骨小梁数量。同时,DPs和VSEE能显著上调骨骼中Wnt3a、LRP-5、β-catenin以及小肠中occludin、claudin-3蛋白的表达量（P<0.05）,也能显著改善肠道微生物种类组成和比例（P<0.05）。此外,DPs和VSEE能显著降低血清中总胆固醇（Total cholesterol,TC）、甘油三酯（Triglyceride,TG）、低密度脂蛋白胆固醇（Low density lipoprotein cholesterin,LDL-C）水平（P<0.05）,显著升高高密度脂蛋白胆固醇（High density lipoprotein cholesterin,HDL-C）水平（P<0.05）,且明显地减少脂肪细胞大小,减少肝脏组织中脂肪滴聚集。综上所述,DPs和VSEE能通过改善去势大鼠的小肠屏障功能、肠道微生物群落的结构,激活骨代谢和脂质代谢交叉信号通路——Wnt/β-catenin信号通路,进而对雌激素水平降低引起的骨质疏松症和伴随而来的脂质代谢紊乱有明显的改善作用。