3α-HSD/CR、aiiA和3α-HSD/CR-aiik基因转化烟草及表达分析

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人类经济快速发展,大量的废气、废水、废物等排放到环境中,导致环境污染日益严重。3α-HSD/CR基因是睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)的关键酶3α-羟类固醇脱氢酶/碳酰基还原酶(3α-hydroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase,3α-HSD/CR)基因,对环境污染物中的类固醇化合物有很好的降解作用。aiiA基因是从苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis, Bt)中克隆的一种酰基高丝氨酸环内酯酶(acyl homoserine lactones, AHLs)基因。AiiA蛋白对胡萝卜欧文氏软腐病菌(Erwinia carotovora)引起的软腐病具有抑制作用,其机制是将该菌产生的AHLs分子的内酯键打开,使其结构改变,失去信号分子的功能,进而减弱病害。近年来,植物基因工程迅速发展,“超级生物”备受关注,转基因由单基因向多基因方向发展。但是,由于受到目前可选择的载体数目和载体容量的限制,多基因转化困难。融合基因转化以及融合表达载体构建技术的发展,为多基因的遗传转化开辟了一条新途径。本研究构建3α-HSD/CR基因和aiiA基因融合基因植物表达载体并转化烟草,初步研究了融合基因在烟草中的表达。主要方法和结果如下:1.构建了融合基因3α-HSD/CR-aiiA植物表达载体pTCK303-3α-HSD/CR-aiiA,同时构建了两个单基因(3α-HSD/CR和aiiA)植物表达载体pTCK303-3α-HSD/CR和pTCK303-aiiA作为对照,研究融合基因的表达。通过酶切验证及测序表明载体构建成功。2.利用农杆菌介导法将融合基因3α-HSD/CR-aiiA及两个单基因3α-HSD/CR和aiiA转化烟草。经PCR检测及GUS组织化学染色结果表明成功获得转融合基因3α-HSD/CR-aiiA烟草及转单基因3α-HSD/CR和aiiA烟草。3.利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测3α-HSD/CR蛋白在转融合基因3α-HSD/CR-aiiA烟草和转单基因3α-HSD/CR烟草中均成功的表达了。4.采用胆固醇降解试验检测转3α-HSD/CR-aiiA和3α-HSD/CR基因烟草对胆固醇的降解率均达到70%左右,远远高于对照。5.对转3α-HSD/CR-aiiA和aiiA基因烟草离体叶片针刺法接种胡萝卜软腐欧文氏杆菌,结果表明转基因烟草离体叶片对胡萝卜软腐欧文氏杆菌引起的软腐病具有抑制作用。6.由胆固醇降解试验及抗病试验结果表明:转3α-HSD/CR-aiiA融合基因的烟草同时表达了3α-HSD/CR蛋白和AiiA蛋白的功能,获得了对环境具有修复作用的抗病性烟草。
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