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胃癌是我国发病率和死亡率均居第三位的恶性肿瘤。据世界卫生组织统计,2012年我国胃癌发病人数40万,死亡人数32万。而临床各种胃癌化疗方案的有效率仅30%,胃癌五年生存率不足20%。肿瘤耐药性是制约胃癌治疗效果的主要因素。因此,研究肿瘤耐药性产生的分子基础将为发展有效的胃癌耐药逆转策略,提高胃癌治疗效果提供科学依据。顺铂是胃癌化疗常用药物,通过与DNA交联诱导双链断裂损伤发挥细胞毒性作用。肿瘤细胞通过增强DNA损伤修复能力产生对顺铂的耐受性。以往研究发现,核苷酸切除修复途径、同源重组修复途径、非同源末端连接等修复通路均参与修复顺铂所致DNA损伤。如ERCCl、BRCAl、 BRCA2等修复分子的表达与顺铂敏感性有关。XRCC1是重要的DNA修复分子,在碱基切除修复途径中通过招募一系列分子修复各种因素所致的DNA单链损伤,XRCCl同时也参与修复如电离辐射所致DNA双链损伤。但XRCC1在修复顺铂所致胃癌细胞DNA损伤,调节胃癌细胞顺铂耐药性中的作用则尚未有报道。JWA是一个典型的环境应答基因。着眼于JWA在肿瘤发生发展过程中的作用,我们前期结果显示,JWA通过正调控XRCC1及LigⅢ等碱基切除修复途径中关键分子的表达,修复氧化应激所致DNA单链损伤,维护基因组稳定性,抑制肿瘤发生。肿瘤细胞中JWA在三氧化二砷、依托泊苷诱导的线粒体凋亡途径中通过MAPK信号通路发挥促进细胞凋亡的作用。本课题组前期对胃癌组织芯片及其术后生存随访中研究发现,癌组织中JWA和XRCC1的表达水平通常是一致的且都低于癌旁组织,与病人的预后呈显著负相关；JWA与XRCC1的表达水平与铂类化疗方案所致总体生存率有关。JWA与XRCC1低表达患者可以从铂类化疗方案中受益,而JWA和XRCC1高表达患者则不能,提示JWA和XRCC1可能在调节铂类药物疗效中起重要作用。目的：研究胃癌细胞顺铂耐药性产生及逆转的分子基础。方法：本研究通过构建胃癌顺铂耐药细胞株,细胞分子生物学技术比较耐药细胞与敏感细胞的DNA损伤修复能力的改变、XRCC1、JWA表达差异,结合二维电泳—质谱分析蛋白质组学差异,探讨XRCC1、JWA等分子表达与胃癌细胞顺铂耐药关系及其分子机制；结果：1.胃癌顺铂耐药细胞DNA修复能力显著增强,抵抗顺铂诱导的细胞凋亡。通过浓度梯度法构建BGC823/DDP、 SGC7901/DDP两株耐药细胞,在相同浓度顺铂处理时,敏感细胞可发生显著的DNA损伤和细胞凋亡,而耐药细胞则几乎不发生DNA损伤和细胞凋亡。2.胃癌顺铂耐药细胞中XRCC1表达上调,抑制顺铂所致细胞毒性效应。免疫印迹结果显示耐药细胞中XRCC1表达显著增加。在BGC823细胞中转染RFP-XRCC1表达质粒上调XRCC1表达可以显著抑制顺铂诱导的DNA损伤及细胞凋亡,减少顺铂所致细胞毒性效应。在BGC823/DDP细胞中转染XRCC1shRNA质粒抑制XRCC1表达可以显著增加顺铂诱导的DNA损伤及细胞凋亡,增强顺铂所致细胞毒性效应。3.在顺铂诱导DNA损伤过程中,P-CHK1、FANCD2、DNA-PK与XRCC1可被激活参与DNA修复。DNA-PK与XRCC1共定位至损伤位点,XRCC1可能通过非同源重组修复途径介导顺铂诱导的DNA损伤修复过程。4. TXNL1通过泛素—蛋白酶体途径负调控XRCC1表达。二维电泳—质谱法筛选发现耐药细胞中TXNL1表达显著下降。在BGC823/DDP细胞中,TXNL1与XRCC1表达呈相反趋势。TXNL1shRNA抑制BGC823细胞TXNL1表达可以上调)RCC1表达,而flag-TXNL1表达质粒回复BGC823/DDP细胞中TXNL1表达可以下调XRCC1表达。TXNL1通过泛素—蛋白酶体途径负调控XRCC1表达；5.伊立替康抑制XRCC1的表达,联合顺铂有效杀伤耐药细胞。耐药细胞对伊立替康无交叉耐受性,伊立替康处理激活BGC823/DDP细胞中TXNL1表达,从而抑制XRCC1的表达,伊立替康联合顺铂显著杀伤BGC823/DDP细胞,提高其对顺铂的敏感性；6.TXNL1和XRCC1在胃癌组织中表达呈负相关。在103例胃癌组织标本制作的组织芯片中及12例新鲜胃癌组织中检测发现,TXNL1与XRCC1的表达呈相反趋势。7.在正常胃上皮细胞中JWA正调控XRCC1表达,修复顺铂所致DNA损伤。在正常胃上皮细胞GES-1中转染JWA siRNA抑制JWA表达可以增加顺铂所致DNA损伤,而转染flag-JWA升高JWA表达可以抑制顺铂所致DNA损伤,同时观察到XRCC1表达上调。共转染flag-JWA和XRCC1siRNA削弱JWA对XRCC1的正调控作用则可阻断JWA对顺铂所致DNA损伤的修复功能。8.胃癌敏感细胞中JWA失去对XRCC1的调控功能,但促进顺铂所致DNA损伤和细胞凋亡。在胃癌细胞BGC823、SGC7901中转染JWA siRNA抑制JWA表达可以减轻顺铂所致DNA损伤,而转染flag-JWA升高JWA表达可以加重顺铂所致DNA损伤,同时观察到XRCC1表达水平并不随JWA改变而改变。9.胃癌耐药细胞中JWA负调节XRCC1表达,促进顺铂所致DNA损伤和细胞凋亡。胃癌耐药细胞中JWA表达水平相对于敏感细胞降低,XRCC1表达水平升高,两者表达趋势发生背离,推测耐药细胞中损伤修复—细胞凋亡网络发生紊乱。回复JWA表达后则抑制XRCC1表达,促进顺铂诱导的DNA损伤和细胞凋亡。10.胃癌耐药细胞中JWA通过CK2抑制XRCC1磷酸化,促进其降解。通过构建XRCC1磷酸化位点突变质粒与flag-JWA质粒共转染发现,XRCC1518S/519T/523T磷酸化位点突变后阻断JWA对XRCC1的负调控作用。进一步研究发现,JWA是通过负调节CK2表达,抑制了XRCC1的518S/519T/523T位点磷酸化,从而促进其降解。结论：本研究首次阐明XRCC1在胃癌细胞内修复顺铂所致DNA损伤的重要作用及其分子机制,首次发现TXNL1通过泛素一蛋白酶体途径调控XRCC1表达及TXNL1-XRCC1作为胃癌患者个体化治疗标志物的潜在价值。揭示了伊立替康作为铂类方案耐药患者二线治疗首选药物的分子机制。本研究首次提出在胃癌细胞顺铂耐药发展过程中分子网络发生紊乱,JWA—CK2—P.XRCCl—XRCCl异常信号通路的激活维持了胃癌细胞对顺铂耐药性。本研究成果将为发展有效的肿瘤耐药分子标志物,制定针对性治疗方案提供科学依据。