干扰素刺激基因（Interferon-stimulated Genes,ISGs）是在病毒体入侵期间由干扰素（Interferon,IFN）刺激细胞后上调的一大类蛋白的统称。其中,干扰素刺激基因15（Interferon-stimulated gene product 15k D,ISG15）是最早被发现的ISGs之一,ISG15的蛋白产物属于泛素样蛋白,由两个与泛素具有高度同源性的结构域串联而成,且成熟的ISG15蛋白与泛素具有一致的C末端基序（LRLRGG）因此与泛素在生物学上具有相似的生物学功能,可以通过一个三级的酶级联反应系统与靶蛋白的赖氨酸残基以共价键的形式结合,从而实现对靶蛋白的翻译后修饰,这一过程称为ISG修饰（ISGylation）。目前认为ISG修饰作用不仅能够作用于病毒蛋白,还可以修饰宿主自身蛋白来调控蛋白的生物学功能。然而,由于ISG15基因在不同的哺乳动物间仅有50%的同源性,因此猪宿主蛋白ISG修饰的功能和ISG修饰的蛋白靶点目前暂无研究。本研究通过利用实验室前期研究自行制备的一株猪ISG15特异性单克隆抗体对干扰素刺激后的永生化猪肺泡巨噬细胞系CRL-2843进行ISG修饰蛋白的富集,随后通过质谱及蛋白组学分析得到宿主蛋白上ISG特异性修饰靶点,进一步从中挑选ISG修饰酶联系统中的关键E3连接酶HERC6（HECT and RLD domain containing E3 ubiquitin protein ligase family member 6）为研究对象,通过对质谱所鉴定到的HERC6潜在ISG修饰赖氨酸残基的突变,对HERC6的ISG修饰靶点进行鉴定,从而研究其生物学功能。本研究的主要工作和结果如下:1.ISG修饰蛋白的蛋白组学分析:首先使用猪ISG15特异性单克隆抗体通过免疫沉淀富集干扰素刺激后的CRL-2843细胞内发生ISG修饰蛋白,进行酶切和质谱检测以确定潜在的ISG修饰靶蛋白,分析获得分布于98个宿主蛋白上共190个潜在的ISG修饰位点。通过基因本论（Gene Ontology,GO）注释和富集分析以及这些蛋白质的蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-protein Interaction,PPI）网络分析,结果表明发生在猪细胞内的ISG修饰的靶蛋白主要位于宿主代谢途径,尤其是核苷酸代谢途径。另外,一些ISGs及相关蛋白质也可能为ISG修饰的靶蛋白。这些数据表明猪ISG15的抗病毒功能可能依赖于对宿主代谢途径的调节及通过ISG修饰调控某些干扰素刺激基因介导的抗病毒调控机制来实现。2.确定猪ISG修饰系统中的关键蛋白E3连接酶HERC6为干扰素刺激基因:以干扰素刺激的CRL-2843细胞c DNA为模板,成功克隆出猪HERC6基因,测序后利用DNAStar进行多重序列比对,发现猪HERC6与人类HERC6和小鼠HERC6有显著的差异性。随后利用大肠杆菌表达了猪HERC6蛋白C端300个氨基酸的截断体,免疫BALB/c小鼠,获得猪HERC6的多克隆抗体。使用IFN-α和IFN-λ刺激细胞后,细胞内的猪HERC6在m RNA水平和蛋白水平上都发生了上调,确定了HERC6是一种干扰素刺激基因。3.猪HERC6所介导的ISG修饰机制:将CRL-2843细胞内HERC6表达敲低后,经IFN处理观察到ISG修饰减少,将编码猪HERC6与猪ISG15的质粒共转染到HEK-293T细胞后,在不经IFN处理的情况下,观察到细胞内出现了明显的ISG修饰现象。提示猪HERC6可以作为一种ISG化修饰系统的E3连接酶,介导猪源ISG15的ISG修饰作用,且这种修饰依赖于E3连接酶HERC6的存在而不依赖于外源性干扰素刺激。在单独转染猪ISG15质粒至人源HEK-293T细胞,外源性干扰素刺激无法介导猪ISG15偶联至靶蛋白发生ISG修饰,表明不同于泛素修饰系统,宿主蛋白ISG修饰的发生赖于物种特异性ISG15和E3连接酶HERC6在细胞内的配对存在。4.猪HERC6自身ISG修饰位点的鉴定与功能鉴定:根据蛋白组学分析确定了猪HERC6的两个ISG修饰赖氨酸残基,通过重叠PCR分别构建了这两个位点点突变的重组质粒,将突变体与野生型HERC6分别与ISG15共转染HEK-293T细胞后,通过免疫共沉淀富集HERC6蛋白检测ISG修饰并在全细胞上检测细胞内总蛋白ISG修饰水平,结果显示转染HERC6突变体的细胞ISG修饰程度相较野生型HERC6有所下降,证明HERC6自身可被ISG修饰,同时证明HERC6自身的的ISG修饰可以促进其作为E3连接酶的活性而增强细胞内总蛋白的ISG修饰。