赭曲霉毒素A（Ochratoxin A,OTA）是由曲霉菌属和青霉菌属的某些菌株产生的一种真菌毒素,其在自然界中的污染非常普遍,广泛存在于粮食、饮料、饲料和动物组织中。研究发现OTA具有肝毒性、神经毒性、免疫毒性、致癌性等生物学效应。由于其自然源性、普遍存在性及较高的化学稳定性,OTA在食品加工、储存或运输过程中均可产生并长期存在,人类不可避免的每天都会或多或少的摄入OTA。本研究团队前期研究表明,OTA是河北省食管癌胃癌高发区居民最常见的饮食污染真菌毒素中的重要毒素。因此,了解OTA毒性作用的潜在机制,确定合适的解毒方案和控制措施,对人类和动物的健康具有至关重要的作用。活性氧（reactive oxygen species,ROS）是细胞内有氧代谢过程中产生的具有很高生物活性的含氧化合物的总称,其可作为第二信使参与信号转导,启动多种细胞生物学效应。但当各种外源或内源性因素引起的ROS超过体内的清除能力时,就会导致ROS水平升高,引起细胞内DNA、蛋白质、脂质等生物大分子损伤,即发生氧化应激。已有文献报道OTA可以诱导人肝细胞和肾脏细胞DNA氧化应激损伤。我们前期研究亦发现,OTA作用于人胃粘膜上皮（GES-1）细胞,可以引起ROS升高,造成氧化应激DNA损伤。细胞一旦发生氧化应激DNA损伤就有可能会诱发死亡、修复、基因突变、甚至癌变等一系列的级联反应。但是,氧化应激损伤在OTA诱发食管黏膜上皮细胞氧化应激损伤中的作用目前尚不明确。线粒体是细胞内最重要的细胞器,不仅为细胞生命活动提供能量,还在细胞凋亡中发挥重要调控作用。线粒体既是ROS的主要来源,又是ROS的主要攻击靶点,极易受到氧化应激的影响而导致结构和功能异常,包括线粒体膜电位的降低、呼吸链复合体活性的改变、氧化磷酸化水平的降低等。线粒体功能障碍可参与激活caspases级联反应和Bcl-2家族成员（Bcl-2和Bcl-x L等）以及Bax和Bad等为标志的线粒体凋亡通路,还可以通过抑制氧化磷酸化关键酶的表达引起能量代谢途径的异常。近来的研究发现,一些致癌性物质,包括霉菌毒素,可以通过氧化应激介导线粒体损伤,进而导致细胞凋亡或糖代谢途径异常:棒曲霉素通过调节ROS介导的线粒体功能障碍和caspase信号通路诱导HEK293细胞发生凋亡;黄曲霉毒素B1在诱导小鼠肝细胞脂肪变性时,会发生氧化应激介导的线粒体功能损伤及糖代谢途径包括糖酵解和三羧酸循环的异常。我们前期研究发现OTA可以诱导Het-1A细胞发生凋亡,然而,其发生是否与OTA诱导的线粒体氧化应激损伤有关目前尚不清楚。同时,OTA对Het-1A细胞糖代谢的影响及其与线粒体氧化应激的关系仍需进一步研究。因此,本研究从ROS作用靶点——线粒体这一角度入手,进一步深入研究OTA对人食管上皮细胞Het-1A线粒体的功能、凋亡以及糖代谢的毒性损伤作用。目的:从细胞内ROS的生成、线粒体损伤、糖代谢、凋亡几个方面观察OTA对Het-1A细胞的毒性损伤作用。方法:1.细胞培养与处理正常人食管黏膜上皮细胞（Het-1A）培养于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素的DMEM培养基中,37℃、5%CO2培养,细胞贴壁生长。选择细胞随机分为溶剂对照组和实验组。实验组给予不同浓度OTA,继续培养24 h收集细胞进行相关指标检测。2.蛋白免疫印迹（Western blot）OTA处理Het-1A细胞24 h后,提取细胞总蛋白,用蛋白免疫印迹方法,检测OTA处理后人食管黏膜上皮细胞Het-1A中SOD2、Rad51、γ-H2AX、凋亡相关蛋白以及PDHK1、IDH1和OGDH表达的影响。3.RNA提取和q RT-PCR实验OTA处理细胞24 h后,用TRIzol试剂提取Het-1A细胞总RNA,用RT试剂盒将其反转录成c DNA,然后用SYBR Premix Ex Taq试剂盒进行PCR扩增。使用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。4.细胞存活率检测不同浓度OTA处理Het-1A细胞24 h后,采用CCK-8实验,用多功能酶标仪检测450 nm处的吸光值,并计算细胞存活率。5.线粒体分离实验收集Het-1A细胞,加入线粒体分离试剂,用玻璃匀浆器匀浆10-30次,将细胞匀浆离心两次以获得胞浆和线粒体蛋白质。6.流式细胞技术检测细胞ROSOTA作用24h后,分别收集各组细胞,PBS洗涤,加入DCFH-DA探针,避光孵育30 min,流式细胞仪检测细胞中ROS变化情况。7.SOD活性检测收集已处理好的细胞,加入SOD样品制备液裂解细胞,离心后取上清作为待测样品,根据试剂说明书进行处理,最后用酶标仪检测其450 nm处的吸光度,并用BCA试剂盒检测蛋白浓度。8.GSH含量检测OTA作用24h后,收集细胞,加入细胞沉淀体积3倍量的蛋白去除剂M溶液,充分混匀。利用液氮和37℃水浴对样品进行两次快速的冻融,离心后取上清用于总谷胱甘肽含量的测定。9.细胞免疫荧光染色Het-1A细胞处理结束后,冰丙酮固定,每孔加入0.5%Triton X-100透化细胞,经山羊血清封闭后,加入LC3B一抗,4℃孵育过夜。第二天加入Alexa Fluor 594标记山羊抗兔荧光二抗,最后用DAPI对细胞核进行染色,共聚焦显微镜观察并采集图像。10.线粒体膜电位（Δψm）检测将Het-1A细胞接种于六孔板中,OTA处理24 h后,PBS洗2次,加入5μM的JC-1探针,37℃避光孵育30 min。PBS洗净后,用荧光显微镜观察并采集图像。11.线粒体呼吸链复合体I活性检测不同剂量OTA处理Het-1A细胞24 h后,收集细胞并在冰上匀浆,两次离心后在沉淀中加入提取液,超声波处理后用酶标仪测定340 nm处的吸光度值,并根据试剂盒说明计算呼吸链复合体I的活性。12.葡萄糖和乳酸含量检测OTA处理细胞24 h后,分别吸取上清,根据葡萄糖和乳酸检测试剂盒说明书要求,加入相应的试剂,置于37℃10分钟,用多功能酶标仪分别检测505 nm和530 nm处的吸光度,同时提取细胞总蛋白,并定量,根据吸光度和蛋白浓度计算葡萄糖和乳酸含量。13.脂质氧化（MDA）检测Het-1A细胞干预结束后,收集细胞,加入PBS进行匀浆,离心后取上清按照试剂盒说明书顺序加入相应的试剂,沸水浴加热15分钟,冷却后离心,用酶标仪测定532 nm处的吸光度值,并根据说明书计算MDA含量。14.统计所有的数据均应用SPSS Statistics17.0统计软件进行分析,结果用x±SD表示,计量资料各组间差异采用单因素方差分析（ANOVA）,P<0.05认为有显著差异。结果:1.OTA对Het-1A细胞存活率的影响显微镜下观察发现5和10μM OTA处理Het-1A细胞24 h后,细胞形态由短梭形变为长梭形,细胞数量较对照组明显减少（P<0.05）。CCK8结果显示,5和10μM OTA处理24 h后,Het-1A细胞存活率明显下降（P<0.05）。表明OTA可以抑制Het-1A细胞的增殖。2.OTA对Het-1A细胞内ROS水平及MDA含量的影响流式细胞术结果显示,2.5、5和10μM OTA处理24 h后,Het-1A细胞中ROS水平较对照组显著升高（P<0.05）。与ROS结果相似,5和10μM OTA处理后,Het-1A细胞内MDA含量也显著升高（P<0.05）。提示OTA可以诱导Het-1A细胞发生氧化应激。3.OTA对Het-1A细胞抗氧化酶的影响SOD检测试剂盒检测发现,暴露于10μM OTA的Het-1A细胞中SOD的活性明显升高（P<0.05）。RT-PCR和western blot检测结果显示SOD的m RNA和蛋白水平有升高趋势,但是与对照组相比,没有统计学意义。而不同剂量OTA处理的细胞中GSH的含量均明显增加（P<0.05）。提示OTA不同程度的影响了抗氧化酶的表达及活性。4.OTA对Het-1A细胞DNA损伤的影响免疫印迹试验表明,OTA作用于Het-1A细胞24h后,可以上调γ-H2AX的蛋白水平（P<0.05）。免疫荧光结果观察到OTA处理组Het-1A细胞形成了典型的γ-H2AX焦点,证实了DNA损伤的发生。对DSBs修复的关键蛋白Rad51的研究结果显示,OTA可以明显降低Rad51的m RNA和蛋白水平（P<0.05）,这些结果进一步证实了OTA的基因毒性作用。5.OTA对Het-1A线粒体功能的影响免疫荧光染色结果显示,在对照组,JC-1以聚合物的形式存在于线粒体基质中,呈现红色荧光。而给予10μM OTA处理后,聚合物减少,JC-1单体（绿色荧光）则明显增加,表明OTA处理可以降低Het-1A细胞的线粒体膜电位。同时5μM和10μM OTA处理组Het-1A细胞的线粒体呼吸链复合体I活性较对照组明显降低（P<0.05）,进一步证明了OTA对线粒体的损伤作用。6.OTA对Het-1A细胞凋亡的影响流式细胞术结果显示,不同浓度OTA处理Het-1A细胞后,细胞凋亡率在5和10μM处理组明显增加（P<0.05）。细胞免疫荧光染色观察到OTA处理组出现了显著的核收缩和染色质凝聚。Western blot结果显示,与对照组相比,OTA暴露组Bcl-2、Bcl-xl、caspase-3和caspase-9的表达显著下降（P<0.05）,Bax、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9的表达以及胞浆内细胞色素酶C释放量显著升高（P<0.05）,提示OTA可以激活Het-1A细胞的线粒体凋亡途径。7.OTA对Het-1A细胞糖酵解的影响葡萄糖检测试剂盒检测结果显示,与对照细胞相比,10μM OTA处理的Het-1A细胞葡萄糖消耗显著增加（P<0.05）。乳酸检测试剂盒检测结果显示,10μM OTA处理可提高Het-1A细胞的乳酸产量（P<0.05）。以上研究结果表明,OTA促进了Het-1A细胞的糖酵解过程。8.OTA对Het-1A细胞糖代谢相关酶的影响RT-PCR和western blot检测结果显示,OTA处理可以增加PDHK1的m RNA和蛋白表达水平（P<0.05）。同时与对照组相比,经OTA处理后,三羧酸循环关键酶（异柠檬酸脱氢酶IDH1和α酮戊二酸脱氢酶OGDH）的蛋白和m RNA水平表达均明显下降（P<0.05）。综合以上结果,OTA通过下调三羧酸循环关键酶的表达,抑制了Het-1A细胞的氧化磷酸化代谢途径。结论:1.赭曲霉毒素A（OTA）诱导人食管黏膜上皮Het-1A细胞发生氧化应激DNA损伤。2.氧化应激损伤介导的线粒体功能障碍参与OTA诱导的细胞凋亡过程。3.OTA诱导线粒体损伤以及糖代谢相关酶表达失调使Het-1A细胞的糖代谢转变为以糖酵解为主。