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黄连解毒汤(Huang-lian-Jie-du decoction,HLJDD)是清热解毒的代表方剂,可用于治疗胃肠道疾病。溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)是一种以结直肠黏膜及黏膜下层炎症和溃疡性病变为主的炎症性肠病。为探讨HLJDD对急性UC的治疗效果及其作用机制,本研究评价了HLJDD对小鼠急性UC模型的疗效,并从分子水平对其部分作用机制进行了研究。进一步通过体内药效学实验筛选了HLJDD抗溃疡有效部位,并探讨了HLJDD及其有效部位对UC模型小鼠肠道菌群的影响。在此基础上,结合代谢组学技术与分子模拟对接技术,深入探讨了HLJDD及其有效部位抗溃疡作用机制。方法及结果:(1)给予BABL/c小鼠3.5%葡聚糖硫酸钠饮水使其连续自由饮用7天以建立小鼠急性UC模型,造模的同时每天分别灌胃高(9.2 g/kg)、中(4.6 g/kg)、低(2.3 g/kg)剂量的HLJDD进行治疗,并以柳氮磺胺吡啶(0.45 g/kg)为阳性对照药物。试验期间对各组小鼠临床症状进行疾病活动指数(Disease activity index,DAI)评分。实验结束后,取各组小鼠血浆进行IL-1β,TNF-a和IL-10检测;取结肠组织进行病理学及氧化应激检测,并对各组小鼠结肠组织中NF-κB,Nrf2信号通路关键蛋白及肠粘膜紧密链接蛋白进行WB检测与免疫荧光检测。结果显示,HLJDD能显著缓解UC模型小鼠体重下降及DAI的升高(p<0.05);显著抑制结肠缩短并减轻结肠病理学损伤(p<0.05);显著降低血浆和结肠MPO水平(p<0.05)。此外,HLJDD治疗能显著升高UC小鼠血浆IL-10含量;显著降低IL-1β和TNF-a含量;显著抑制结肠NF-κB p65、p-IKKα/β、p-IKBα蛋白表达(p<0.05);HLJDD治疗后UC小鼠结肠NO,MDA含量显著降低(p<0.05),而GSH,SOD含量和Nrf2,Keap1蛋白表达水平显著升高(p<0.05)。另外,HLJDD治疗还可增加UC小鼠结肠粘液蛋白分泌,并可显著恢复肠黏膜紧密链接蛋白(ZO-1,Occludin)表达(p<0.05)。以上这些结果以HLJDD中剂量组的效果最佳。(2)利用索氏提取器结合系统溶剂提取法,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水对HLJDD水煎液的冻干粉进行提取,浓缩干燥后获得HLJDD不同极性部位。建立小鼠急性UC模型的同时分别灌胃HLJDD及其不同极性部位(4.6g/kg,以生药材计算)连续治疗7天,以筛选HLJDD抗溃疡有效部位。采集HLJDD及其有效部位治疗后小鼠盲肠内容物,对肠道菌群16S rRNA的V3~V4高变区基因进行测序与分析。结果显示,HLJDD-正丁醇部位(HLJDD-n-butanol,HLJDD-NBA)的得率最高(64.45%)。HLJDD-NBA治疗不但能显著地降低UC小鼠DAI,显著改善结肠组织病理学损伤,而且具有显著的抗炎和抗氧化效果(p<0.05),且这些作用与HLJDD相比均无明显差异。肠道菌群检测结果显示,HLDD和HLJDD-NBA治疗不仅能显著降低UC模型小鼠肠道菌群α多样性,而且能抑制UC模型小鼠肠道内有益菌群(如:Lactobacillus,Parabacteroides,Prevotella等)相对丰度的减少和病原菌(如:Escherichia,Odoribacter,Alloprevotella等)的滋生。此外,HLJDD和HLJDD-NBA还可显著的纠正UC小鼠肠道菌群功能紊乱。(3)采用基于高效液相色谱串联三重四极杆质谱的代谢组学技术及多元统计分析方法对HLJDD和HLJDD-NBA治疗后UC小鼠血浆代谢物进行检测和分析。分别筛选模型组与各组间差异代谢物,并对共有差异代谢物进行代谢通路的富集分析。最后,查阅文献并采用分子模拟对接技术分析HLJDD或HLJDD-NBA中主要活性成分对潜在靶标代谢通路的分子调控机制。结果显示,HLJDD及HLJDD-NBA均可通过回调UC小鼠体内24个差异代谢物的异常变化而显著的改善UC小鼠代谢功能紊乱,且花生四烯酸代谢通路和甘油磷脂代谢通路为二者作用的靶标代谢通路。进一步的文献研究及分子模拟对接分析结果显示,HLJDD可抑制COX-2蛋白表达,且HLJDD中13个活性成分均具有抑制靶标代谢通路中关键蛋白酶(PLA2和5-LOX)活性的潜力。结论:(1)HLJDD可通过抑制NF-κB信号通路,激活Nrf2信号通路和增强肠粘膜屏障功能而有效地治疗小鼠急性UC;(2)HLJDD-NBA为HLJDD治疗小鼠急性UC的有效部位;(3)HLJDD及HLJDD-NBA均可通过抑制UC小鼠肠道菌群结构紊乱和恢复肠道菌群正常功能而维持UC小鼠肠道菌群稳态;(4)花生四烯酸代谢通路和甘油磷脂代谢通路为HLJDD及HLJDD-NBA治疗小鼠急性UC的靶标代谢通路;(5)HLJDD及HLJDD-NBA可能是通过抑制COX-2蛋白表达,5-LOX和PLA2酶活性来抑制花生四烯酸代谢通路和甘油磷脂代谢通路的异常紊乱,进而治疗小鼠急性UC。综上所述,本研究证实了HLJDD对小鼠急性UC的治疗效果并筛选了其有效部位,也揭示了其部分作用机制,为扩展HLJDD临床应用范围提供了科学依据,也为中药复方精制和抗溃疡新药的研发奠定了基础。