背景MicroRNA (miRNA)是调控型小分子非编码RNA, miRNA与其靶分子以及调控其自身表达的转录因子组成了一个复杂的调节网络,参与细胞增殖、分化、凋亡、应激等重要生命过程的调控。miR-9是脑内富集型miRNA,在神经系统发育过程中不仅能促进神经细胞发育和分化,而且还参与调节神经元轴突生长、分支以及定向。miR-9的异常表达与认知功能障碍疾病密切相关,研究人员发现在阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)病程早期,颞叶皮层内miR-9的水平增高,抑制靶基因SIRT1(sirtuin1)阻止神经元微管相关蛋白tau过度磷酸化来发挥保护机制；而在病程晚期,由于p-淀粉样蛋白沉积下调miR-9水平,导致tau蛋白异常磷酸化,神经细丝聚集进而形成神经原纤维缠结(NFTS), NFTS与AD认知功能障碍成正相关。本实验室前期在EPAC无效突变(EPAC-/-)小鼠模型中也检测到前脑miR-9水平明显降低,这种小鼠与正常对照小鼠相比空间学习记忆能力和社交能力均有损伤。这些研究提示我们miR-9水平降低可能会影响学习记忆功能。突触可塑性是学习记忆神经环路的重要基础,miR-9水平降低是否也会损伤到突触可塑性?目前对miR-9影响突触可塑性及学习记忆的分子机制研究尚不明确。Foxp2基因(Forkhead box protein P2,叉头框P2基因)是人类发现的第一个语言相关基因,广泛分布于大脑,并且具有多重miRNA结合位点。研究发现Foxp2对语言基因表达网络系统的调控路径,也会影响人类中枢神经系统的发育。Foxp2作为细胞核内的转录调节因子发挥着重要的基因调控功能,其中很多靶基因对于突触可塑性如神经轴突的生长、树突的重构、神经传递等起到关键性作用。生物学信息技术预测Foxp2基因是miR-9的靶基因,但miR-9是否通过负性调控Foxp2影响突触可塑性和学习记忆功能尚不明确。目的1.确定miR-9和Foxp2之间的靶向调控关系。2.明确miR-9是否通过负性调控Foxp2影响突触可塑性和学习记忆功能。方法采用侧脑室立体定位注射锁核苷酸修饰的反义寡核苷酸分子LNA-miR-9抑制C57BL/6成年雄性小鼠脑内miR-9水平；Morris水迷宫检测小鼠空间学习记忆能力；条件性恐惧实验检测小鼠情绪记忆能力；构建过表达miR-9的重组质粒；分别用重组质粒和LNA-miR-9转染HEK293细胞获得miR-9过表达和miR-9抑制的表型细胞；采用实时荧光定量PCR检测miR-9和Foxp2mRNA水平；采用免疫组化检测Foxp2蛋白在全脑分布；采用膜片钳电生理技术检测突触传递可塑性；采用高尔基染色检测突触形态结构可塑性；采用免疫印迹检测Foxp2蛋白和突触相关蛋白的水平；采用RNAi技术沉默脑内Foxp2蛋白水平。结果1.miR-9靶向调控核转录因子Foxp2体外细胞实验中我们构建了过表达miR-9的重组质粒并转染入HEK293细胞,获得miR-9过表达的表型细胞。同样通过转染将LNA-miR-9导入HEK293细胞内,产生miR-9抑制的表型细胞。转染48h后实时荧光定量PCR检测转染细胞miR-9水平,72h后免疫印迹检测转染细胞Foxp2蛋白水平。结果显示细胞内过表达miR-9会降低Foxp2蛋白水平,而抑制miR-9则增高Foxp2蛋白水平。动物实验中我们通过侧脑室立体定位注射将LNA-miR-9导入C57成年小鼠全脑,分别检测脑内海马和皮层细胞中Foxp2蛋白水平,发现下调miR-9后海马和皮层Foxp2蛋白水平明显增高,同时我们也发现转染细胞和小鼠海马和皮层细胞的Foxp2mRNA水平都没有发生变化。以上结果说明miR-9和Foxp2之间存在直接的靶向调控关系,这种调控作用可能是通过转录后翻译机制而不是促使Foxp2mRNA的降解来完成。2.下调C57成年小鼠脑内miR-9水平损伤其空间学习记忆及情绪记忆能力脑内下调miR-9水平后我们用Morris水迷宫检测C57成年小鼠空间学习记忆,选择条件性恐惧实验检测海马依赖性及非海马依赖性恐惧记忆。结果显示miR-9下调小鼠在水迷宫定位航行训练中潜伏期明显延长,在空间探索检测中小鼠在目标象限停留时间缩短,穿梭原平台位置的次数显著减少；条件性恐惧实验中miR-9下调小鼠在场景条件恐惧和声音条件恐惧检测中的僵直时间百分比均有增强。因此抑制脑内内源性miR-9水平明显诱导C57成年小鼠空间学习记忆损伤及海马依赖性和皮层依赖性恐惧记忆障碍。3.下调C57成年小鼠脑内miR-9水平损伤突触形态结构和传递功能可塑性动物行为学实验后采用高尔基染色比较并分析小鼠海马CA1区锥体神经元和皮层神经元树突棘密度和蘑菇型树突棘比例的变化。我们发现下调miR-9明显降低海马CA1区锥体神经元和皮层神经元的树突棘密度,抑制蘑菇型树突棘(“记忆型”树突棘)形成；用电生理膜片钳技术记录海马CA3-CA1环路的LTP,发现下调miR-9明显抑制LTP的诱导和维持；免疫印迹检测突触相关蛋白的水平变化,发现突触小体相关蛋白SNAP-25及突触后谷氨酸受体NRl、NR2A、NR2B、GluR1亚基和支架蛋白PSD-95水平均有不同程度的降低。以上结果说明下调miR-9损伤C57成年小鼠海马和皮层突触的形态结构和传递功能可塑性。4.沉默Foxp2逆转miR-9抑制表型所致空间学习记忆和情绪记忆能力的损伤我们在C57成年小鼠脑内抑制内源性miR-9水平后再采用RNAi技术沉默脑内Foxp2基因,然后检测小鼠空间学习记忆和情绪记忆能力的变化。水迷宫和条件性恐惧实验结果显示：与miR-9下调小鼠相比,在miR-9抑制表型小鼠脑内沉默Foxp2后,小鼠在水迷宫定位航行训练中潜伏期缩短,在空间探索检测中目标象限停留时间延长,穿梭原平台位置的次数也增多；条件性恐惧实验中小鼠在场景条件恐惧和声音条件恐惧检测时僵直行为恢复正常。因此下调miR-9所致空间学习记忆和情绪记忆障碍能够被沉默Foxp2所逆转。5.沉默Foxp2逆转miR-9抑制表型所致突触形态结构和功能可塑性的改变沉默Foxp2逆转miR-9抑制表型的行为学实验后,我们用高尔基染色统计分析海马CA1区锥体神经元和皮层神经元的树突棘密度及蘑菇型树突棘的比例,发现抑制miR-9水平后下降的树突棘密度及蘑菇型树突棘比例在沉默Foxp2后恢复正常；免疫印迹检测海马和皮层突触相关蛋白水平,发现抑制miR-9所致海马和皮层突触小体相关蛋白SNAP-25及突触后谷氨酸受体NR1、NR2A、NR2B、GluR1亚基和支架蛋白PSD-95水平的降低也能被沉默Foxp2所逆转；沉默Foxp2同样能够改善抑制miR-9后所致海马CA3-CA1环路LTP的损伤,因此沉默Foxp2能够逆转miR-9抑制表型所致突触形态结构和功能可塑性的改变。结论本课题研究从基因表达与基因功能两层面证实miR-9与核转录因子Foxp2之间存在直接靶向调控关系。下调miR-9减少海马CA1区锥体神经元和皮层神经元的树突棘密度及蘑菇型树突棘的比例；降低海马和皮层突触相关蛋白水平；损伤海马CA3-CA1环路的LTP,从而诱导突触可塑性损伤,C57成年小鼠出现空间学习记忆及情绪记忆障碍。miR-9降低引起的Foxp2蛋白增高是其中的关键环节。沉默Foxp2能够逆转miR-9抑制表型所致突触可塑性的损伤以及学习记忆障碍。本课题的研究结果不仅证明了miR-9对Foxp2的靶向调控在学习记忆动能中的重要作用,也为临床通过miR-9的基因调控网络干预学习记忆障碍提供了理论基础。背景鸟嘌呤核苷酸交换蛋白(exchange protein directly activated by cAMP, EPAC)是一种新的环磷酸腺苷效应分子。EPAC有两种亚型即EPAC1与EPAC2, EPAC1/2蛋白含有一个鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)和一个或两个cAMP结合的调节模序。当cAMP结合EPAC的调节模序后,激活Ras样的小GTP酶Rap,参与调控细胞增殖、分化、凋亡等重要生理病理过程。EPAC1-Rap信号通路能够调控心血管内皮细胞生长和血管构建,EPAC2则参与分泌胰岛素的调控过程。虽然EPAC1/2基因在全脑高表达,但是EPAC1/2信号通路在脑内的功能至今尚未明确。本课题组前期研究发现EPAC基因突无效变(EPAC-/-)会降低小鼠海马突触前末梢的谷氨酸递质释放,由Kir6.1亚基与SUR1受体结合构成的ATP敏感型钾通道(KATP)主要位于海马突触前末梢,敲除SURl基因(SUR1-/-)或Kir6.1基因(Kir6.14)明显增加小鼠癫痫发作易感性,但EPAC信号通路能否通过调控KATP通道开放来改变海马突触前传递功能从而影响癫痫发作尚不清楚。目的1.明确EPAC蛋白与齿状回颗粒细胞Kir6.1/SUR1型ATP型敏感钾通道之间的作用关系。2.探讨E PAC蛋白与KATP之间关系对小鼠突触前谷氨酸神经递质释放及癫痫发作的影响。方法我们用基因靶向技术制备EPAC1、EPAC2、SUR1单基因以及EPAC1/EPAC2双基因无效突变小鼠。采用全细胞膜片钳技术记录海马DG区神经元自发性兴奋性突触后电流(sEPSC)。采用双波易化实验(paired-pulse facilitation)刺激DG区苔藓纤维(mossy fiber),记录海马CA3区诱发的NMDA受体介导的兴奋性突触后电流(EPSCNMDA)。采用腹腔注射红藻氨酸(Kainic acid, KA)建立小鼠癫痫模型,观察小鼠癫痫发作情况并进行等级评分。结果本课题组前期研究发现,在海马组织EPAC2351-458与SUR1859-881直接作用,抑制KATP通道开放。为明确EPAC无效突变是否能通过调节KATP通道开放来改变海马DG区突触前谷氨酸递质释放,我们采用全细胞膜片钳技术记录DG区神经元sEPSC,与野生型小鼠相比,EPAC-/-小鼠sEPSC频率明显降低,而幅度没有改变。采用双波易化实验记录CA3区诱发的EPSCNMDA发现EPAC无效突变抑制苔藓纤维突触前Ca2+依赖性谷氨酸神经递质释放。给予SUR1859-881多肽特异性干扰EPAC-SURl结合也能明显降低海马DG区颗粒细胞sEPSC频率,抑制双波易化实验,模拟EPAC无效突变表型。本课题组早先研究结果显示,由Kir6.1亚基与SURl受体结合构成的KATP通道主要位于海马突触前末梢,敲除SURl基因(SUR1-)或Kir6.1基因(Kir6.1-/-)明显增加小鼠癫痫发作易感性。为了探讨EPAC调控突触前谷氨酸神经递质释放对癫痫发作的影响,我们采用腹腔注射红藻氨酸来建立癫痫动物模型,比较并分析EPAC无效突变小鼠和野生型对照小鼠；SUR1859-881和SUR1-/-SUR1859-881对照小鼠癫痫发作的潜伏期和发作严重程度。实验数据显示：EPAC无效突变小鼠和表达SUR1859-881多肽的野生型小鼠癫痫发作的严重程度均明显降低。结论我们的研究从生理功能和病理状态两方面确定EPAC蛋白是齿状回颗粒细胞Kir6.1/SUR1型ATP敏感型钾离子通道的功能组成部分。EPAC蛋白通过直接抑制SUR1受体降低KATP通道开放率,增加突触前谷氨酸递质释放从而升高癫痫易感性。此项研究为临床利用EPAC调控突触可塑性的分子机制研制出新的抗痫药物提供了理论基础。