论文部分内容阅读
现代肿瘤治疗已经从传统的手术、放疗、化疗治疗模式向综合型治疗模式转变。分子靶向药物的作用已经开始凸现,其中血管生成抑制剂通过阻断血管形成来抑制肿瘤的生长是目前应用前景可观的一种治疗策略。脱氧核酶是基因治疗技术的一种崭新的分子生物学工具,通过将RNA分子在配对的嘧啶和未配对的嘌呤之间切断,从而调控基因的表达。本研究通过针对VEGFR-1mRNA设计合成10-23型脱氧核酶,观察其在体内外阻断血管生成的作用,并通过小鼠黑色素瘤模型、人鼻咽癌移植瘤模型评价10-23型脱氧核酶DT18的生物学效应。研究表明,靶向VEGFR1的脱氧核酶具有抗肿瘤尤其是治疗鼻咽癌的临床应用前景。第一部分目的：靶向VEGFR-1mRNA脱氧核酶的设计及生化鉴定。方法：通过in silico设计针对血管内皮生成因子受体VEGFR-1的10-23DNAzyme。合成硫代化修饰的脱氧核酶,通过体外切割实验、小管形成实验筛选出活性良好的脱氧核酶,并以动力学实验分析其生化活性。活性脱氧核酶经TMP转染HUVEC,倒置显微镜观察HUVEC对FITC荧光素标记的脱氧核酶的摄取,流式细胞仪检测转染效率,免疫印迹检测脱氧核酶的生物学活性。结果：针对不同区域的靶位点设计了靶向VEGFR-1mRNA序列11条,分别合成10-23DNAzyme。通过体外切割实验、小管形成实验筛选到活性良好的脱氧核酶DT18。动力学参数分析实验显示DT18对底物在50秒就开始发生作用,且随着时间的延长,切割产物也随之增多。DT18经TMP转染后24h即可在显微镜下看见约50%的细胞发出绿色荧光,流式细胞仪检测转染效率为80%；免疫印迹检测发现DT18能明显抑制VEGFR-1的表达。相对于对照组,实验组的小管形成能力明显减弱。结论：成功筛选到活性良好的靶向VEGFR-1mRNA的脱氧核酶。第二部分目的：体内水平探讨10-23脱氧核酶DT18抑制血管新生的生物学效应。方法：实验分为三组：脱氧核酶组(DT18group)、寡核苷酸对照组(INV-Ctrl group)和生理盐水组(saline group)。通过角膜微囊袋法建立鼠角膜血管形成模型,在显微镜下观察DT18对角膜新生血管面积和数量的影响；建立黑色素瘤细胞B16移植瘤小鼠肿瘤模型,观察DT18是否通过靶向VEGFR-1影响肿瘤生长；DT18细胞转染入B16细胞,MTT实验检测DT18对细胞增殖的影响。结果：DT18明显抑制了角膜血管的新生,相对于生理盐水组,实验组减少了72%的血管面积和61%的血管数量。与对照组、生理盐水组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。成功构建血管丰富且VEGFR-1高表达的黑色素瘤移植鼠模型。利用该模型,DT18明显抑制了肿瘤的生长,相对于对照组与生理盐水组,各组肿瘤体积的差异具有统计学意义(P<0.05)。利用转染试剂Fugene成功将DT18细胞转染入B16细胞,48h后在荧光显微镜下可见到80%的细胞发出绿色荧光,MTT实验证实DT18不影响细胞的增殖(P>0.05)。结论：成功建立了鼠角膜血管形成模型、黑色素瘤小鼠模型；并以体内实验模型验证了经过硫代化修饰的10-23DNAzyme DT18通过靶向VEGFR-1明显抑制血管新生,进而抑制肿瘤生长。第三部分目的：利用分子影像学手段探讨靶向VEGFR1’脱氧核酶对鼻咽癌移植瘤血管通透性和血管生成的影响。方法：将鼻咽癌移植瘤裸鼠模型随机分为3小组：脱氧核酶组(DT18group)、寡核苷酸对照组(INV-Ctrl group)、生理盐水组(saline group)。待肿瘤体积长至60-100mm3后进行肿瘤内注射用药,肿瘤内每周两次多点注射20μ1的注射液,包含3μl的fugene口100μg的DT18(或生理盐水或者INV-CONTROL),共给药7次,第18天终止实验,期间测量肿瘤大小和小鼠体重。并于干预结束后行常规MRI和DCE-MRI,获得移植瘤肿瘤组织的Ktrans值。移植瘤标本分别行VEGFR1免疫组化染色。结果：反映肿瘤血管通透性的Ktrans值在脱氧核酶处理组与寡核苷酸对照组、生理盐水组与移植瘤肿瘤组的差别有统计学意义(实验组和对照组比较P=0.028,实验组和生理盐水组比较P=0.026)。脱氧核酶处理组与寡核苷酸对照组、生理盐水组移植瘤体积变化的差别有统计学意义(P<0.05)。免疫组化结果表明,脱氧核酶处理组VEGFR1表达显著低于,寡核苷酸对照组和生理盐水对照组。结论：结合免疫组化和Ktrans值证实靶向VEGFR1mRNA脱氧核酶可导致鼻咽癌移植瘤血管生成和血管通透性下降,移植瘤肿瘤体积减小。其病理生理学基础是靶向VEGFR1脱氧核酶在移植瘤内能够通过抑制VEGFR1的表达来抑制血管新生,从而抑制肿瘤生长Ktrans值可为探讨靶向EBV-VEGFR1mRNA脱氧核酶进行鼻咽癌的临床实验提供实验依据。第四部分目的：靶向VEGFR-1mRNA脱氧核酶DT18的药代动力学及安全性初步评价。方法：1.药代动力学分析：32p标记的DT18(1mg/ml2001)通过尾静脉注射Balb/c鼠,注射剂量为10mg/kg,,在不同的时间点(3只鼠/时间点)分别通过眼眶静脉丛穿刺采血法抽取0.5ml外周血。离心获取血清,并通过苯酚/氯仿萃取DT18。用Southern印迹和标准曲线对DT18浓度进行定量检测。药代动力学参数通过软件计算。2.毒理分析：将30只Balb/C鼠随机分为生理盐水组(Saline组10只)、对照组(INV-Ctrl组10只)和实验组(DT18组10只),每只老鼠均给予单次尾静脉注射,DT18组和INV-Ctrl组剂量为20mg/kg。给药2周内评估各组老鼠的体重变化、摄食情况,两周后收集小鼠外周血液,行血常规、肝肾功能、免疫功能检查,检测主要脏器指数并行主要脏器病理学检查。结果：1.DT18以10mg/kg的剂量经尾静脉注射入小鼠体内,实验期间大鼠未见明显异常行为。通过药代动力学软件计算,分布半衰期为0.1hr,消除半衰期为46.7hr,最大血药浓度为84.4mg/ml,药物浓度-时间曲线下面积为97mg/ml hr,表观分布体积为890ml/kg。2.各组大鼠在给药期间和恢复期未出现毒性反应和死亡现象,DT18组体重变化、脏器指数、摄食情况、血常规、肝肾功能、淋巴细胞CD3+/CD4+/CD8+比例以及主要脏器病理检查与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论：DT18具有良好的较好的药物耐受性和安全性,具有潜在的临床应用前景。