急性缺血性心血管疾病是指由血管内形成的血栓或栓塞引起急性器官循环障碍造成组织损害的一类疾病。临床表现为急性缺血性心力衰竭、不同程度的心绞痛和心肌梗死等症状。发病率和死亡率仅次于癌症,仅有少数急性病人可在发病3小时以内被确诊并接受血管再通治疗。95%以上的病人因其病程/病情发展,丧失了进行最佳的血管再通治疗机会。另外随时间的推移即使打开栓阻,由于血和氧的突然增加也会造成缺血再灌注损伤。因此,治疗急性缺血性心脑血管疾病的核心是在最短的时间内给被阻塞的组织和器官及时提供氧份以减少由于缺氧所造成的器官和组织坏死,保护缺氧的组织和器官,延长最佳治疗时间;同时也要控制氧的供应量以避免溶栓时的再灌注所引起的氧、炎性因子和自由基等所引起的再灌注损伤。目前,临床上主要采用针对时间窗内的溶栓和疏通梗阻的一些方法,如溶拴剂和支架介入治疗,而缺乏在最短时间内对缺氧组织直接供氧的药物。血红蛋白类氧载体(Hemoglobin-based oxygen carriers,HBOCs)是在游离的去膜无基质血红蛋白分子基础上,添加交联剂或者聚合剂,形成分子内交联或者分子间聚合的一类具有类似于红细胞携氧释氧以及扩容功能的的大分子聚合物。具有无需交叉配型、便于运输、稳定储存、且不易受病毒微生物感染等一系列优点,具有良好的开发应用前景。实验室采用的戊二醛聚合猪血红蛋白(polymerized porcine hemoglobin),是在猪血红蛋白分子基础上添加戊二醛交联剂合成的一种血红蛋白类氧载体,因其远远小于红细胞(7-8um)的分子直径,仅为20nm左右,当血管发生病变形成栓塞时,其可通过血管腔内的狭窄间隙,及时为缺血区域的细胞和组织供氧。此外,pPolyHb含有heme基团,heme被报道可诱导血红素加氧酶HO-1的合成,HO-1具有抗氧化应激与抗炎能力,此外,缺血/再灌时会产生大量的ROS导致线粒体功能障碍,进一步损伤细胞。因此,功能紊乱的线粒体必须得以及时清除以减少ROS的大量生成。研究发现,线粒体自噬能够有效清除功能紊乱的线粒体以及过量产生的ROS,确保细胞内线粒体功能正常稳定。本论文首先选择大鼠H9C2心肌细胞系建立细胞缺氧复氧模型,根据MTT分别检测pPolyHb对于正常细胞以及缺氧复氧细胞存活率的影响,检测细胞上清液中的LDH和CK活性,选择最适pPolyHb1OuM和20uM两个浓度组,建立缺血再灌注损伤模型;其次,探究pPolyHb对H9C2细胞缺血再灌注损伤的影响,主要检测炎性因子TNF-α、IL-1β、抗炎性因子IL-10的表达,采用Annexin V-FITC法检测各组细胞凋亡率,western blot检测凋亡蛋白Bax、Bcl-2和CytC以及HO-1的表达水平;最后为了揭示pPolyHb对H9C2细胞缺氧/复氧损伤中线粒体自噬的诱导分子机制,检测线粒体自噬蛋白Parkin、Pink1表达的变化以及线粒体自噬抑制后细胞凋亡情况。实验结果显示,pPolyHb能够有效提高缺氧复氧后细胞生存活力,细胞毒性检测指标LDH以及损伤指标CK活性相较于缺血再灌注损伤I/R组呈明显降低趋势,并且pPolyHb能够有效恢复缺氧/复氧后细胞生长形态。AnnexinV-FITC法检测各组细胞凋亡率结果显示pPolyHb能够改善细胞凋亡,减轻心肌缺血再灌注损伤,凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和CytC的表达水平显示,pPolyHb复氧后能够提高抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,同时降低促凋亡蛋白CytC和Bax的表达量,减轻心肌缺血再灌注损伤引起的细胞凋亡,同时,pPolyHb可降低炎性因子TNF-α、IL-1β、以及升高IL-10的表达发挥抗炎作用,并且能够通过诱导HO-1的表达参与心肌细胞缺血再灌注损伤保护作用的调节。此外,线粒体自噬相关蛋白Pink1、Parkin表达结果显示,pPolyHb复氧后,能够有效诱导这两种蛋白的表达,并随着复氧时间的延长,蛋白表达量逐渐降低;采用线粒体分裂抑制剂抑制线粒体自噬后,结果显示细胞抗凋亡相关蛋白Bcl-2含量下降,促凋亡蛋白Bax、CytC表达上升,证实pPolyHb复氧可能通过激活适度的线粒体自噬调节细胞凋亡,进而缓解缺血再灌注损伤。