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瓜类细菌性果斑病(bacterial fruit blotch of watermelon,BFB)是威胁世界西甜瓜产业的一种毁灭性的细菌性种传病害。它在西瓜和甜瓜上快速传播并造成严重损失,同时也可以危害黄瓜、南瓜等其它葫芦科作物。BFB因其破坏力强、危害范围广、传播速度快的特点,成为我国出入境检验的重要对象。引起瓜类细菌性果斑病的病原菌是西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli),革兰氏染色阴性,单根极生鞭毛,通过附着在种子表面传播。前期研究发现,A.citrulli中一个Lux R家族转录调控因子AcrR可影响其致病性和运动性等表型,尤其对鞭毛形成具有调控作用,并且编码基因acr R与上游基因acr K具有双组分调控系统的结构特征。为明确AcrR与AcrK是否形成双组分调控系统,以及AcrR对A.citrulli运动性和致病性的调控机制,本研究以A.citrulli野生型菌株Aac-5为研究对象,通过生物信息学分析、构建acr K/acr R单突变与双突变菌株,验证双组分调控系统对致病性和运动性等生物学特性的影响;通过细菌双杂、GST-pulldown证明二者存在互作关系;通过蛋白磷酸化测定验证AcrK和AcrR形成双组分调控系统;通过构建Ch IP表达菌株并致病性等其他表型,从而来探究acr K/R调控系统对西瓜噬酸菌运动性的调控机制。结果如下:(1)AcrK/AcrR对西瓜噬酸菌运动性和致病性具有调控作用通过构建acr K单突变与acr K acr R双突变及互补菌株,并进行了致病性、运动性及鞭毛运动结果的分析。单突变与双突变菌株致病性下降、运动性丧失、不能形成鞭毛,回补菌株各表型均恢复至野生型菌株的水平。说明AcrK/AcrR对西瓜噬酸菌的运动性和致病性具有关键调控作用。(2)AcrK与AcrR存在互作生物信息学分析结果表明,AcrK是信号转导组氨酸激酶,AcrR是Lux R家族转录调节子,二者在结构上存在双组分系统的结构特征。通过细菌双杂和GST pull-down验证AcrK与AcrR存在互作。细菌双杂结果表明,通过构建质粒acr Kp KT25/acr Rp UT18,acr Kp UT18/acr Rp KT25,电转入感受态,均有蓝色单菌落产生,说明AcrK与AcrR存在互作。GST pull-down实验结果表明,通过构建AcrR-GST融合蛋白作为诱饵,能够捕获目的蛋白AcrK,说明AcrK与AcrR存在互作。以上结果均验证了AcrK与AcrR蛋白间的相互作用。(3)AcrK/AcrR形成双组分调控系统通过异源表达纯化并获得了AcrK和AcrR蛋白,然后加入ATP与PKA自磷酸化缓冲液开始磷酸化反应,混合后置室温孵育相对应的时间。在经过孵育后AcrK蛋白磷酸化,磷酸化后的AcrK蛋白在加入AcrR蛋白后使用western blotting检测,结果显示磷酸化后的AcrK蛋白磷酸转移到了AcrR蛋白上,说明AcrK可将AcrR磷酸化,二者可形成双组分调控系统。(4)AcrR的Ch IP菌株表型与野生型相同,可用于后续调控机制分析使用3个不同抗生素标记的载体构建了AcrR的Ch IP表达菌株,p BBRTet-a cr RHA-Δacr R、p BBRKam-acr RHA-Δacr R和p BBRAmp-acr RHA-Δacr R,通过对Ch IP表达菌株的运动性、致病力、鞭毛形成、烟草过敏性反应、体外生长速率等生物学表型进行测定,发现3个Ch IP表达菌株的以上表型均恢复了生物学功能,说明导入的p BBRTet-acr RHA-Δacr R、p BBRKam-acr RHA-Δacr R、p BBRAm p-acr RHA-Δacr R重组质粒在表达菌株体内得到正常的表达,而且表达的蛋白与野生型菌株表达的蛋白功能相同,可以用于后续Ch IP方法捕获与目的蛋白结合的DNA,明确AcrK/AcrR对西瓜噬酸菌运动性和致病性的调控机制。