见血封喉(Antiaris toxicaria(Pers.)Lesch.),又名箭毒木,其为桑科(Moraceae)见血封喉属(Antiaris)的植物,在我国是国家三级保护植物,主要分布于广东(雷州半岛)、海南、广西、云南西双版纳,也是地球上最毒的木本植物。在人类使用见血封喉的历史中,其树干中的白色乳汁被用来制作毒箭射杀猎物。在中国民间见血封喉可作药用,用来治疗腹泻和作为麻醉剂使用。初步研究表明,见血封喉中分离出来的主要生物活性物质为强心甙类化合物,此类化合物主要被报道具有加强心肌收缩力的作用,最近也发现其具有很好的肿瘤细胞毒性。还没有文献对见血封喉镇痛活性进行报道,文献主要报道其抗肿瘤活性。为了进一步寻找新的见血封喉中具有药用价值的生物活性成分,我们采用活性追踪策略,对西双版纳产的见血封喉树皮的化学成分及镇痛与抗骨肉瘤活性功能进行了研究。本研究使用多种分离纯化技术和膜片钳技术,从见血封喉树皮乙醇提取物中鉴定出一种具有镇痛和抗骨肉瘤活性的化合物,AAC-RG。本研究的第一部分,将探讨AAC-RG的镇痛活性。我们采用萃取,大孔树脂柱,Rp-C18高效液相色谱手段,从见血封喉树皮乙醇提取物中分离出来了 AAC-RG,同时在分离纯化的每一步,利用膜片钳技术检测化合物对大鼠背根神经节细胞上电压门控钠离子通道的活性。在得到纯品后,我们发现AAC-RG能专一抑制电压门控钠离子通道,其IC50为241 μM,而对电压门控钾离子通道、钙离子通道没有作用。对电压门控钠离子通道动力学研究发现,AAC-RG使通道的激活曲线向去极化方向移动,而对通道的稳态失活曲线没有影响。将钠通道的亚型(Nav1.3-1.5,Nav1.7,Nav1.8)在HEK293细胞上表达,并检测AAC-RG对钠通道亚型的选择性,结果表明该化合物能选择性抑制Nav1.5和Nav1.8而对其它检测的亚型没有作用。AAC-RG作用于Nav1.8和Nav1.5的IC50为293 μM和182 μM。我们利用了 3种镇痛模型(福尔马林诱导的舔足模型、热导致的甩尾模型、醋酸诱导的扭体模型)来探究AAC-RG的镇痛活性。发现AAC-RG能够降低醋酸引起的小鼠扭体次数,能显著地减少福尔马林在Ⅰ相时期的累计舔足时间。但是AAC-RG对小鼠在甩尾模型中对热痛的反应时间没有明显延长,也对福尔马林诱导的Ⅱ相炎症性疼痛没有显著抑制效果。这表明AAC-RG能显著地抑制神经痛,而对炎症和热诱导的疼痛没有抑制效果。本研究中我们还对AAC-RG另外一种功能(抗骨肉瘤)进行了研究。我们对AAC-RG的细胞毒性进行了筛选,发现AAC-RG对骨肉瘤MG-63细胞有最好的抑制效果。随后我们检测了 AAC-RG对非肿瘤细胞的毒性,发现AAC-RG对非肿瘤细胞毒性不大,只对人胚肺细胞HEC有抑制作用,这些实验结果说明AAC-RG的细胞毒性具有选择性。使用实时细胞分析仪分析了 AAC-RG作用后细胞数量的实时变化,发现MG-63细胞在刚接触药物后会发生5小时左右的快速增殖,随后细胞数量才会激剧下降。通过对细胞凋亡和侵袭力的检测,我们发现AAC-RG作用MG-63细胞后会导致大量细胞凋亡,并且能减弱MG-63细胞的侵袭力。但是通过细胞周期实验,我们发现AAC-RG对MG-63细胞周期的影响不大,推测AAC-RG应该不是细胞周期类抗肿瘤药物。于是,我们检测了 AAC-RG作用MG-63细胞后活性氧的含量变化,发现AAC-RG能够迅速导致细胞产生活性氧。我们建立了裸鼠原位的骨肉瘤模型,对AAC-RG在体内的抑制骨肉瘤的效果进行评价,发现AAC-RG在裸鼠体内能有效地杀灭骨肉瘤细胞,并显著提高实验裸鼠的生存率。在确定AAC-RG在体内能发挥药效后,我们采用表达谱测序,ELISA和Western blot的方法探讨了 AAC-RG诱导骨肉瘤MG-63细胞死亡的机制。综合细胞实验的结果,我们发现AAC-RG能激活caspase-3/7引起细胞凋亡,同时AAC-RG还能导致活性氧的产生,JNK信号通路被激活,诱发细胞程序性坏死。凋亡和坏死共同促进了 AAC-RG诱导骨肉瘤MG-63细胞死亡的过程。综上,AAC-RG具有一定的镇痛作用和优秀的抗骨肉瘤活性。该研究对理解疼痛和细胞死亡机制具有重要意义,同时为抗骨肉瘤药物和镇痛药物的开发提供了参考。