目的:本研究以中药耐药大肠杆菌E.coli CP9为供体菌,以金黄色葡萄球菌S.aureus RN450RF为受体菌,针对在质粒复制、接合转移及其调控中分别起决定作用的Mpf系统（接合配接对形成系统）及Dtr系统（DNA转移及复制系统）展开研究。探讨大肠杆菌中药耐药的发生机制、低浓度中药液相接合条件下对质粒接合转移的影响机制及分析中药耐药大肠杆菌质粒的性质,为减少耐药基因传播提供实验依据。方法:本研究分为四个部分。1.致肾盂肾炎大肠杆菌中药耐药诱导实验:应用分子蒸馏技术取得中草药水溶性提取物中的小分子物质作为实验药物。以临床分离的大肠杆菌E.coli CP9为实验菌株。采用琼脂二倍稀释法测定E.coli CP9的药物最低抑菌浓度（MIC）,在含1/2MIC药物的M-H肉汤培养基中进行培养传代,诱导其产生耐药。挑单个菌落测定药物诱导后MIC,如药物诱导后MIC≥4倍诱导前MIC则定为耐药。2.中药耐药质粒性质的鉴定实验:以中药耐药大肠杆菌E.coli CP9（实验一诱导后）为供体菌,采用Alkaline lysis法提取其质粒。以感受态细胞E.coli DH5α、金黄色葡萄球菌S.aureus RN450RF为受体菌。在体外进行质粒转化感受态细胞实验以及质粒接合转移实验。应用碱裂解法提取培养后的转化子质粒及转接合子质粒,分别与耐药菌原质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测。3.Western blot法测定Trf A基因编码的复制起始蛋白的表达和免疫活性实验:以带有抗性质粒的E.coli CP9为实验菌株,以无抗性的E.coli CP9为对照菌株。应用尿素法制备细菌总蛋白质组样品,经变性处理后,加样进行SDS-PAGE电泳实验。电泳结束后,将分离凝胶上的蛋白质条带转移到NC膜上。兔抗血清anti-Trf A作为一抗,山羊抗兔Ig G/HRP作为二抗,应用HRP-ECL化学发光进行免疫检测。4.PCR法检测中药耐药质粒中tra基因的表达:以中药耐药大肠杆菌E.coli CP9为实验菌株,以大肠杆菌E.coli J96为对照菌株,应用碱裂解法提取细菌质粒。以中药耐药质粒DNA为模板,利用Oligo软件,根据tra基因锌指蛋白保守区序列设计10对引物。配制50μL PCR反应体系,于设定好的PCR仪上扩增。PCR结束后,取PCR产物进行电泳检测。结果:1.应用分子蒸馏技术,取得中草药水溶性提取物中的小分子物质,作为实验药物,相当于0.5g生药/ml。实验药物的理化性质为:呈淡棕色,粘度505c P,相对密度0.9886-0.9890,吸光度0.351-0.355,旋光度+10.90,折射1.2066-1.2068,p H值5.6-5.7。（图1-2/1-3/1-4/1-5）2.致肾盂肾炎大肠杆菌E.coli CP9、金黄色葡萄球菌S.aureus RN450RF,均为临床分离菌株,经细菌自动鉴定仪鉴定。其生物学特性:（1）E.coli CP9:β-hemolysis,O4/K54/H5 serotype,P pilus（class I Pap Gadhesin）,aerobactin minus genotype;（2）S.aureus RN450RF:RN450 derivation,phenotypeαPhage-free,RifrFusr.3.多组观察“温阳通淋汤”对致肾盂肾炎大肠杆菌的体外抗菌活性,并通过比较“温阳通淋汤”不同提取组分对大肠杆菌的体外抗菌活性,确定“温阳通淋汤”的主要有效成分为中草药水溶性提取物中的小分子物质（图1-6）。4.药物最低抑菌浓度（MIC）实验显示:实验可以看到明显的抑菌圈（图1-7）,E.coli CP9的MIC1为50g/L,抑菌圈直径为2mm（表1-2）。S.aureus RN450RF的MIC2为25g/L,抑菌圈直径为11mm。临床受试菌和质控菌生长情况以及大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌情况一致,未呈现临床菌株对中药制剂的耐药性。5.次抑菌浓度（1/2MIC）药物诱导耐药实验显示:药物诱导实验前,大肠杆菌E.coli CP9的药物最低抑菌浓度MIC为50g/L,抑菌圈直径为2mm（图1-8）。药物诱导实验后,大肠杆菌E.coli CP9的药物最低抑菌浓度MIC为250g/L,区域直径为4mm（图1-9）。药物诱导后MIC≥4倍诱导前MIC,故可确定次抑菌浓度（1/2MIC）药物可诱导大肠杆菌E.coli CP9产生耐药,大肠杆菌E.coli CP9亦确定为中药耐药大肠杆菌菌株。6.质粒转化感受态细胞实验显示:中药耐药大肠杆菌E.coli CP9（实验一）为供体菌,感受态细胞E.coli DH5α为受体菌。采用Alkaline lysis法提取耐药菌E.coli CP9中的质粒,将耐药质粒与感受态细胞E.coli DH5α在肉汤交配后,在含有中草药混合物的平板上检测到转化子。所有转化合子都针对中草药混合物的连续稀释液进行测试,并且发现其对中草药混合物具有抗性,MIC为250g/L,区域直径为4mm。琼脂糖凝胶电泳检测发现:在中药耐药大肠杆菌E.coli CP9中检测到大小为45kb的质粒DNA片段,但在交配前在大肠杆菌E.coli DH5α中不存在。交配后,大肠杆菌E.coliDH5α的转化合子被观察到含有该片段（图2-1）并表现出对中草药混合物的抗性。质粒转化实验证明:质粒片段可以从大肠杆菌E.coli CP9转化到大肠杆菌感受态细胞E.coli DH5α中,该质粒的存在使E.coli DH5α菌株中草药混合物的MIC从12.5g/L增加至250g/L。7.质粒接合转移实验结果显示:中药耐药大肠杆菌E.coli CP9（实验一）为供体菌,金黄色葡萄球菌S.aureus RN450RF为受体菌,于L-B肉汤培养基中培养中。体外交配后,在含有中草药混合物的平板上检测到了转接合子。体外抑菌实验显示:转接合子对中草药混合物具有抗性,MIC为125g/L,区域直径3mm。该质粒的存在使金黄色葡萄球菌S.aureus RN450RF中草药混合物的MIC从25g/L增加至125g/L。将转接合子做传代培养,发现质粒持续存在于下一代金黄色葡萄球菌中,其仍显示出对中药混合物的抗性。此外,在比较质粒质谱后发现:中药耐药大肠杆菌和转接合子含有相同大小（45kb）的质粒,其在交配前在金黄色葡萄球菌S.aureus RN450RF中不存在（图2-2）。8.蛋白质印迹实验结果显示:以中药耐药大肠杆菌E.coli CP9（带有抗性质粒）为实验菌株,以大肠杆菌E.coli CP9（无抗性）为对照菌株。以兔抗血清anti-Trf A为一抗,以山羊抗兔Ig G/HRP抗体为二抗。在带有抗性质粒的大肠杆菌E.coli CP9样品中观察到了明亮的荧光条带（33k Da和44k Da特异性蛋白条带）,但在对照样样品中却没有观察到（图3-1）。蛋白质印迹实验表明:由trf-A基因编码的Trf A-33蛋白（33k Da）和Trf A-44蛋白（44k Da）在大肠杆菌E.coli CP9（带有抗性质粒）中成功表达,即中药耐药质粒具有复制的起始条件。9.PCR结果显示:以E.coli CP9（带有抗性质粒）为实验菌株,以E.coli J96为对照菌株。通过碱裂解提取的E.coli CP9质粒DNA样品中有8条清晰的条带可见,但是对照组样品中未检测到扩增带（图4-1）。扩增产物之间的大小、片段长度和荧光强度可做区分,包含orf1（406bp）,orf2（1035bp）,orf4（433bp）,orf5（359bp）,orf6（322bp）,orf7（326bp）,orf8（932bp）和orf10（690bp）共8个开放阅读框。PCR实验结果表明:中药耐药质粒包含调控性菌毛的形成和接合配接对形成的tra基因,这不仅为质粒的接合转移提供了必要的先决条件,同时还是接合型质粒的特征标记。结论:1.次抑菌浓度药物（1/2MIC）可诱导大肠杆菌E.coli CP9产生耐药;2.中药耐药大肠杆菌E.coli CP9的质粒携带抗性基因,该质粒可通过接合转移和/或转化的方式在不同种属菌株间传递;3.中药耐药质粒中含有调控复制起始蛋白编码的Trf A基因;4.中药耐药质粒中含有调控细菌接合转移和转化的tra基因;5.中药耐药大肠杆菌质粒的性质为接合型质粒。即:中药耐药大肠杆菌E.coli CP9中提取的质粒:携带抗性基因、包含DNA复制（或称为复制起点）所需的必需核苷酸序列,以及控制细菌接合和转移的tra基因。故中药耐药大肠杆菌质粒的性质为接合型质粒。