生防木霉Sm1-Chit42基因融合工程菌构建及其粗提物防治黄瓜白粉病的研究

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化学农药减量化是现代绿色农业发展和食品安全的重要趋势,尤其在设*施*蔬*菜*病虫害*防治方面的意义尤为重大。本研究以生防哈茨木霉T30菌株作为载体,选择其具有激活植物抗病性功能的几丁质酶Chit42基因、多聚半乳糖醛酸酶PG基因及蛋白激发子Sm1基因,根据结构生物学和生物信息学原理,对融合基因的过表达进行定向分子设计,构建能够表达融合蛋白的Sm1-Chit42及PG-Chit42木霉工程菌。研究以Sm1-Chit42融合基因工程菌为主要对象,获得粉剂初产品,对菌株、融合蛋白、粗提物及粗提物原粉(含灭活蛋白)的体系进行了综合研究。试验结果表明,Chit42单基因、Sm1-Chit42及PG-Chit42融合基因过表达均不影响木霉菌株的生长。在Sm1-Chit42工程菌粗提物中,四种细胞壁降解酶的活性总体略高于野生型T30,均随着发酵时间的增长而提高,培养第6 d时达到最大值,几丁质酶、多聚半乳糖醛酸酶、纤维素酶及β-1,3-葡聚糖酶的活性依次为57.40 U/m L,2.17 U/m L,1.86 U/m L及37.11 U/m L,多聚半乳糖醛酸酶活性变化较明显。为了便于应用推广和保存,将Sm1-Chit42工程菌粗提物制备成高温灭活原粉。对比检测发现,Sm1-Chit42工程菌粗提物原粉中丙氨酸与谷氨酸含量最高且增加最多,含量分别提高1009.38 ng/mg与1013.59 ng/mg。在Sm1-Chit42工程菌粗提物原粉中,Ca元素与Mg元素的含量较多,分别为51.66 ppm与22.77 ppm,只有Fe元素的含量比T30粗提物原粉中的含量略高。研究发现,Sm1-Chit42工程菌粗提物原粉对灰霉病菌的生长具有一定的抑制效果,但对镰刀菌类真菌的抑制效果不明显。黄瓜盆栽在Sm1-Chit42工程菌粗提物原粉处理后,挑战接种白粉菌(Sparrotheca fuliginea),第7 d时白粉病病情指数最小,CK、T30与Sm1-Chit42处理组的病情指数分别为90.0、78.3、73.3,Sm1-Chit42处理组的黄瓜白粉病相对防效达51.6%。Sm1-Chit42处理组黄瓜的四种防御反应酶的活性均高于对照组,说明黄瓜植株的防御反应被激活;酶活最大值基本集中于处理后48 h,说明Sm1-Chit42工程菌粗提物原粉在黄瓜生长前期对白粉病具有一定预防作用,POD、PAL及SOD的活性依次为1.54 U/g,81.25 U/g,228.34 U/g,CAT活性最大值集中于处理后72h,为53.32 U/g。POD、PAL活性的变化较大,CAT次之,均达显著水平(P<0.05)。在Sm1-Chit42工程菌粗提物原粉处理的黄瓜植株中,茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)浓度总体均呈上升趋势,且两者的变化具有一定对应性。Sm1-Chit42工程菌粗提物原粉处理与CK处理相比,JA的相对增长率为12.56%,SA的相对增长率为21.02%,因此推测Sm1-Chit42工程菌粗提物原粉激发黄瓜对白粉病抗性的信号通路主要为水杨酸信号途径。此外,将Sm1-Chit42工程菌粗提物原粉应用于蔬菜生产上,发现其能够促进韭葱、番茄、黄瓜与樱桃萝卜种子萌发,并对黄瓜植株具有促进生长的作用。
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