糜子耐盐相关bZIP转录因子的筛选与功能研究

来源 :西北农林科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zty85633278
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我国对糜子的研究主要集中在栽培技术、选育新品种、优异农艺性状、农业生产和商业价值的开发以及收集保存种质资源等方面,对其基因的挖掘和利用远远不足。研究盐胁迫下糜子种子萌发机理有利于从源头提高种子的发芽力以及发芽势,从而提高作物的最终产量。充分研究和利用糜子这类自身高耐盐性作物资源,挖掘有利基因,在作物品种改良、增加糜子产区农民收入以及维护国家粮食区域平衡具有重大意义。本实验中,以17个地方品种的糜子(Panicum miliaceum L.)种子为试验材料,分别用清水(RO水)和Na Cl梯度处理糜子种子来模拟盐胁迫,观察并统计其露白时间与发芽率。经统计分析,选出一个耐盐品种和一个盐敏感品种,在种子萌发过程中的两个处理、三个时期分别取样,进行转录组测序(RNA-Seq)实验。通过RNA-seq实验结果,我们发现一类bZIP相关转录因子有较大的差异性表达,暗示此类基因可能参与糜子盐胁迫应答。因此,有效筛选相关基因并深入理解此类基因的功能及工作机制,成为解析糜子耐盐属性的必要途径。对筛选出参与盐胁迫响应的bZIP相关转录因子进行生物信息学分析,推测该基因在盐胁迫下,参与调节种子萌发过程中植物激素信号转导途径,从而使得种子正常萌发。为验证这一推测,我们开展了相关研究,深入解析bZIP转录因子的功能及相关作用机制,具体结果如下:通过基因家族分析鉴定出糜子中144个bZIP转录因子,并对这些转录因子分别命名为PmbZIP1~PmbZIP144,并划分为10个亚族(分别为A至E、G、H、I、S和U);分子量范围为9.19 k Da(PmbZIP59)到68.3 k Da(PmbZIP51);等电点的范围为4.52(PmbZIP102)至11.57(PmbZIP43);在PmbZIP中鉴定出了12个不同的基序(Motif);基因结构分析表明PmbZIP中的内含子数量从0到12不等;启动子分析发现PmbZIPs启动区含有多种顺式作用元件,如植物激素响应元件、MYB结合位点、光响应元件、非生物胁迫响应元件、种子特异性调节元件和根特异性调节元件。基因家族分析为今后糜子中bZIP家族基因的研究奠定基础。对萌发时期的材料进行转录组测序后发现,36个PmbZIP转录因子参与了盐胁迫下种子的萌发。对这些基因的表达量进行差异性分析发现,PmbZIP131,PmbZIP125,PmbZIP33,Pm ABI5,PmbZIP118和PmbZIP97等六个bZIP转录因子在该时期差异表达。进一步对苗期的表达模式进行分析得到:陕北粳糜子(耐盐材料)处理48h后,盐(200 m M Na Cl)、干旱(20%(W/V)PEG6000)和低温(4℃)可明显诱导Pm ABI5的表达,Pm ABI5在榆糜1号(盐敏感材料)处理6h时被ABA(100μM ABA)诱导表达,PmbZIP131在榆糜1号(盐敏感材料)中被ABA、低温和高温(42℃)诱导,在陕北粳糜子中没有明显的表达变化,PmbZIP97、PmbZIP125和PmbZIP118在大多数处理中没有表达变化,榆糜1号的两个U亚族基因(PmbZIP97和PmbZIP89)被ABA、盐、低温、高温和干旱胁迫强烈诱导。将六个基因均在拟南芥中过表达后发现:PmbZIP33,Pm ABI5,PmbZIP118和PmbZIP97均参与调控盐胁迫下种子萌发,使得转基因株系的发芽率显著提高。Pm ABI5、PmbZIP118和PmbZIP97还参与调控萌发后的根系生长,过表达拟南芥的根长、根面积、侧根数均显着高于野生型。由于Pm ABI5过表达拟南芥株系中,各项表型都较为明显,因此将Pm ABI5进一步在水稻中过表达,结果表明过表达Pm ABI5水稻株系同样表现出根系生长明显优于野生型(日本晴),并导致籽粒的粒长相较于转基因受体日本晴有明显变化。双分子荧光互补实验(Bi FC)证明了Pm ABI5蛋白可以与PmbZIP33蛋白和PmbZIP131蛋白形成异源二聚体,也可以自身形成同源二聚体。进一步的酵母单杂交实验证明Pm ABI5和PmbZIP131调控Pm NAC1基因的表达是通过与启动子区的G-box结合来发挥作用。上述分析表明,Pm ABI5可以直接调控种子萌发和幼苗生长,也可以通过与PmbZIP131形成异源二聚体从而调控Pm NAC1基因的表达间接提高植物的耐盐性。
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