表面活性剂是一类具有两亲性（亲水性和疏水性）的化合物,具有着十分广泛的应用。当今使用的大多数表面活性剂都是石油基的化学品。此类化学合成的表面活性剂来源于石油这种不可再生的资源,并且很难通过微生物的作用分解,因此会导致严重的生态问题。生物表面活性剂具有无毒、生物降解性、生物相容性、优异的发泡性、生态友好性、在极端环境下的有效性和稳定性（在广泛的pH值、温度和盐浓度范围内也有活性）以及储存时间长等优点,吸引了越来越多的研究人员的兴趣。槐糖脂是所有生物表面活性剂中产率最高,最有潜力成为化学表面活性剂的可持续替代品的一类重要的生物表面活性剂。关于槐糖脂合成途径的关键酶已被鉴定,但影响槐糖脂合成相关的蛋白或者调控槐糖脂合成相关的转录因子还很少有报道。此外,发酵液的pH不仅影响球拟假丝酵母Starmerella bombicola CGMCC 1576产生的槐糖脂产量,还会影响槐糖脂的组成。而响应pH相关的蛋白与槐糖脂合成关系的研究还未报道。因此,对于影响槐糖脂合成相关蛋白的研究,将有助于了解槐糖脂的合成调控机制,并可用于指导槐糖脂产生菌的遗传操作。关于槐糖脂合成相关转录因子的研究,可以填补S.bombicola槐糖脂合成相关转录因子的空白,并可以此为基础构建高产槐糖脂的工程菌株。本论文的主要研究内容与结果如下:1.槐糖脂合成相关蛋白及调控槐糖脂合成相关转录因子筛选发酵培养基的pH值低于2.0时,S.bombicola主要产生酸型槐糖,当将pH调节至3.0或3.5时,会产生大量的内酯型槐糖脂。已经有学者鉴定了几个参与槐糖脂合成的基因,然而,槐糖脂合成途径的影响和调控机制尚未得到研究。通过生物信息学分析结合S.bombicola基因组数据,首次发现了两个与pH相关的蛋白Bro1和Rlp,并在S.bombicola中影响槐糖脂的合成。通过对不同氮源条件下S.bombicola发酵液的蛋白质组的数据分析,鉴定出4种分泌型天冬氨酸蛋白酶类似蛋白Sapl,并分析了 Sapl蛋白对槐糖脂合成的影响。此外,利用真菌转录因子数据库和S.bombicola基因组测序数据,预测分析可能的转录因子基因,并构建了转录因子的删除株库,约90个转录因子删除株,并分析了突变株的产槐糖脂发酵结果,发现12个转录因子与槐糖脂的合成相关。2.Brol和Rlp蛋白的功能研究为了鉴定Bro1在S.bombicla中的功能,构建了bro1基因的缺失、过表达及回补菌株,发现缺失突变株不再产生槐糖脂,然而,bro1的过表达菌株并不能增加槐糖脂的产量。敲除株的转录组分析表明,Δbro1中槐糖脂生物合成途径关键酶基因的表达水平显著下调,尤其是编码槐糖脂合成途径第一限速酶的cyp52m1表达水平下调13倍,脂肪酸β-氧化的相关酶也被下调。这表明Bro1对于槐糖脂的合成是必不可少的。rlp基因的删除菌株槐糖脂产量达到了 76.53 g/L,提高了 17.9%。结合转录组学分析与实时荧光定量PCR的结果,发现Δrlp中催化UDP-葡萄糖合成以及内酯型槐糖脂合成的酶基因表达量分别上调了 2.1和3.9倍,下调了以UDP-葡萄糖为底物合成直链淀粉酶基因的表达。由于UDP-葡萄糖是槐糖脂合成的关键代谢中间物,因此rlp基因的删除促进碳代谢流更多地流向槐糖脂的合成,从而增加了突变株的槐糖脂产量。3.槐糖脂合成相关转录因子的功能分析筛选的12个与槐糖脂合成相关的转录因子,其中6个转录因子基因的删除菌株的槐糖脂产量出现不同程度的增加,另外6个转录因子基因的删除菌株不再产生槐糖脂。挑选删除菌株中槐糖脂产量增加最多的转录因子ztf1,以及转录因子过表达菌株中产量增加最多的基因swi3和ada2,进行转录组学分析。发现ztf1的删除菌株促进了蔗糖或淀粉代谢转化为葡萄糖的代谢途径,同时增加了丙酮酸前体物质的合成,而丙酮酸的代谢可以提供乙酰辅酶A和ATP用于槐糖脂的合成。Δztf1突变株增加了菌株胞内的葡萄糖来源,同时促进了突变株的碳代谢,从而增加菌株的槐糖脂合成。在swi3和ada2的删除菌株中,槐糖脂合成关键酶基因均发生显著下调。在swi3和ada2的过表达菌株中,一个酯酶基因和ATP依赖的激酶yfh7基因的表达量发生显著上调,Yfh7是功能未知的P环蛋白之一,与许多细胞过程有关,例如信号传导、代谢和调节,酯酶参与酸型槐糖脂的内酯化。swi3的过表达,下调与氨基酸的运输、糖的运输和代谢相关的蛋白酶,ada2的过表达,可能是通过影响脂肪酸代谢、氨基酸代谢、丙酮酸代谢等途径,来改变菌株槐糖脂的产量。4.连续敲除构建高产槐糖脂的工程菌株希望通过削弱槐糖脂合成相关的竞争性途径,促使碳和能量等可以更多地流向槐糖脂的合成,构建高产槐糖脂的工程菌株。以筛选到的影响槐糖脂合成相关的蛋白以及转录因子等为靶点,首先以潮霉素抗性自删除标记构建了 rlp基因的敲除菌株,通过半乳糖的诱导获得了不含筛选标记的Δrlp菌株。在此基础上,继续构建转录因子的敲除菌株,得到了三株双敲除菌株ΔrlpΔztf1,ΔrlpΔleu3和ΔrlpΔgcl,其中ΔrlpΔgcl中槐糖脂产量与单敲除株Δrlp相同,总槐糖脂产量最高的菌株为ΔrlpΔleu3,达到了 93.99 g/L,选择ΔrlpΔgcl为出发菌,构建了三敲除菌株ΔrlpΔleu3Δztf1,总槐糖脂产量达到了 97.44 g/L,对比双敲除株ΔrlpΔleu3,总槐糖脂产量提高了 3.67%,对比野生株,ΔrlpΔleu3Δztf1菌株的总槐糖脂产量提高了 50.15%。并且,该三敲除菌株的总碳源转化率达到0.70（添加到培养基中的总碳源）,高于已报道经发酵优化后的发酵罐的结果0.68（计算基于消耗的碳源）。这表明多基因敲除策略可以用于构建高产槐糖脂的工程菌株,构建的该工程菌株可以以更低的成本用于大规模工业发酵。