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研究背景与目的:原发性肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是高度恶性的肿瘤,每年我国因肝癌死亡的人数超过12万,占全世界肝癌死亡人数的44%左右,病死率高居各类肿瘤的第三位[1]。尽管有肝切除、肝移植、化疗栓塞和新酪氨酸酶抑制剂(如索拉菲尼)等方法可用于肝癌的治疗,但肝癌患者仍呈现频繁复发,甚至在肝移植之后[2]。而免疫治疗特别是细胞免疫治疗可以调节机体免疫功能,改变肿瘤微环境(TME),诱导特异性肿瘤免疫,达到治疗肝癌、减少肝癌复发和转移的目的,已经成为继手术、化疗、放疗后的第四种治疗方式[3]。基于肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor Infiltrating Lymphocytes,TILs)的过继免疫治疗也越来越受到国内外学者的关注。TILs是从肿瘤组织中分离出来的肿瘤抗原特异性淋巴细胞群,含有T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞,主要以T淋巴细胞为主,而T淋巴细胞根据细胞表型可分为CD4+T细胞和CD8+T细胞,其中能发挥杀伤肿瘤作用为CD8+T细胞,其疗效是淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokine-activated killer,LAK)的50-100倍[4-6]。人源肿瘤组织异种移植模型(patient-derived xenograft models,PDX)是指将病人的新鲜肿瘤组织或肿瘤细胞通过原位或异位等方式移植到免疫缺陷小鼠体内,依靠小鼠提供的环境生长的一种异种移植模型[7,8]。这种模型保留了原代肿瘤的微环境和组织病理学及遗传学特征,能模拟人肿瘤异质性,对肿瘤临床前评估、治疗和预后具有重要的转化意义,被认为是目前为止最接近临床研究的相关肿瘤模型,是肿瘤学临床研究非常宝贵的标本[9]。研究表明,CD8+TILs的数量与肿瘤的客观缓解率呈正相关[5 6,10]。目前,国内研究TILs,尤其是CD8+TILs用于肝癌的治疗相对较少,本研究中我们将探讨CD8+TILs在肝癌组织的分布以及高效提取分离、培养扩增CD8+TILs的方法,同时进一步验证CD8+TILs的免疫学特性,为将来应用自体CD8+TILs免疫治疗晚期HCC奠定基础。研究方法:1.肝癌组织标本的苏木素-伊红染色(HE)与免疫组织化学染色(IHC):取癌巢、癌旁组织制成切片,分别行HE染色和细胞表面CD8抗原IHC,研究CD8+TILs在肝癌癌巢和癌旁组织分布;2.肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的提取与鉴定:摸索对比组织块培养法、细针抽吸、混合酶消化法提取TILs,使用吖啶橙(AO)染色判断细胞活性,采用流式细胞学检测TILs表面标志物CD3、CD4、CD8抗原表达以及研究CD4+TILs、CD8+TILs细胞比例;3.体外扩增TILs并分选CD8+TILs:对体外扩增后的TILs使用免疫磁珠法分选其中的CD8+TILs;4.CD8+TILs细胞毒性实验:CD8+TILs与分选后的非CD8+TILs做对比,按效靶比(E/T)为1、5、10分别与肝癌细胞株(Hep G2、Hep3B)共培养,采用CCK8法检测CD8+TILs的肿瘤抑制率以及初步摸索最适效靶比。5.三维立体培养的前期探索:使用携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒转染293T细胞,海藻酸钠包裹转染成功的293T细胞形成微囊,建立三维立体结构培养,通过荧光显微镜下观察微囊内293T细胞的生长情况,进而使用同一病毒感染TILs。6.肝癌PDX模型建立:通过皮下移植肿瘤组织块和皮下接种肝癌肿瘤细胞悬液两种方法造模。肿瘤组织块成瘤法是直接皮下包埋组织块;肿瘤细胞悬液成瘤法是通过混合酶消化法将肝癌患者手术后标本制成肿瘤细胞悬液,接种至裸鼠两侧近腋窝、两侧腹股沟皮下,观察皮下成瘤情况。实验结果:1.肝癌组织标本的苏木素-伊红染色(HE)与免疫组织化学染色(IHC):相对于癌巢组织,CD8+TILs主要分布在癌旁组织,而且主要富集在癌旁组织的汇管区。2.肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的提取与鉴定:采用混合酶消化法提取效果较好,AO染色(Day14)示,细胞活力为(90.5±3.0)%。流式检测CD3+细胞比例为(77.53±16.37)%,CD3+CD4+比例为(27.08±21.56)%,CD3+CD8+比例(44.55±12.73)%。流式检测有CD3细胞表位抗原表达,且高比例,表明提取的细胞大部分都是TILs,且CD8+TILs居多。3.体外扩增TILs并分选CD8+TILs:扩增后细胞数为(1.2~2.5)×10 8,扩增倍数17-50倍。使用免疫磁珠分选出的CD8+TILs数量与流式检测结果基本一致。4.CD8+TILs细胞毒性实验:在非CD8+TILs中,效靶比(E/T)在1、5和10时,抑制率分别为(0.53±2.21)%、(0.30±1.67)%、(75.00±4.90)%(Hep G2)和(1.29±2.83)%、(1.94±2.04)%、(43.54±1.98)%(Hep3B),而在CD8+TILs中,效靶比在1、5和10时,抑制率分别为(1.60±0.23)%、(85.16±3.66)%、(77.74±5.81)%(Hep G2)和(3.35±2.59)%、(81.34±2.32)%、(91.03±2.41)%(Hep3B),SPSS软件采用Bonferroni法分析,在E/T=5或10与E/T=1比较,差异均有统计学意义(P<0.05),而E/T=5与E/T=10比较,差异无统计学意义(P>0.05),结果提示,当E/T=5时,CD8+TILs就能较好发挥肿瘤抑制作用。5.三维立体培养的前期探索:转染的293T细胞在海藻酸钠微囊内可以存活,且培养72小时的细胞数量最多,同时使用慢病毒同样可以转染TILs。6.肝癌PDX模型建立:皮下接种肝癌组织块未成功,但皮下接种肿瘤细胞悬液,约3个月后,有皮下成瘤迹象。结论:本研究证实了CD8+TILs主要富集在癌旁组织汇管区,对比组织块培养、细针穿刺法,混合酶消化法更能高效从人肝癌组织提取出CD8+TILs,改良的扩增方案并实现大量扩增,体外实验进一步表明提取的CD8+TILs具有较强肿瘤抑制作用。初步尝试建立裸鼠肝癌PDX模型,同时,前期实验初步验证了,使用海藻酸钠包裹细胞实现三维立体培养和扩增具有可行性。