水稻株型基因NAL11功能的初步验证

来源 :华南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lwm1976
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水稻是我国主要粮食作物之一,其产量接近粮食总产量的40%。随着农业科技的不断进步,我国粮食生产不断取得新突破。截至2014年,我国粮食生产实现了令人瞩目的“十一连增”,为国家粮食安全提供重要保障。但在播种、总耕地面积持续减少、农业劳动力丧失、土地污染退化、全球气候变化等形势下维持水稻生产安全稳定,是我国农业发展中面临的严峻考验,迫切需要种质材料创新及育种水平的提高。水稻育种上提出超级稻育种策略,本质上是结合并深化理想株型与优势利用的育种理念,是形态与机能兼顾,对地上部、根系、抗性等株型性状优异基因的挖掘和充分利用。水稻的优良株型是实现超高产第三次突破的骨架,合理的株型将改善群体受光姿态,提高光能、水肥和空间利用率,利于产量提高和品质提升,因此对株型的研究具有相当重要的理论指导和实践意义。本研究以前期通过叶宽性状对株型基因NAL11的定位和克隆为基础,以02428与02428-nal11为主要研究对象,通过开展NAL11系统的生物学效应分析,细胞学及微观结构观察,NAL11的基因结构、转录翻译及剪接异构特征、同源比对与系统发育等生物信息分析,NAL11的遗传转化及时空表达特点等研究,对NAL11进行功能的初步验证。主要结果如下:(1)、通过系统考查,确定ZYX具有窄叶、多蘖、细杆、稀穗及小根等特异的株型特点。通过对02428及ZYX与02428构建的近等基因系02428-nal11(BC4F3代)系统的农艺性状调查,确定02428-nal11相较02428表现为显著或极显著的窄叶、多蘖、细杆、低结实率的表型特征,而在根系上表现为总根数较小但更壮实的特点,推测nal11的效应在ZYX复杂的遗传背景受到掩盖或抑制。此外,02428-nal11粒型的长宽比也得到增加。通过以上结果,确定了nal11的生物学效应。(2)、通过对02428与02428-nal11的石蜡切片观察,发现三叶期和成熟期,02428-nal11叶片的叶脉(维管束)总数均显著和极显著小于02428,且02428-nal11成熟期叶片的中脉气腔变小、维管束变小以及薄壁细胞数量减少;02428-nal11茎秆的内外层维管束数量均显著或极显著少于02428,且薄壁细胞层数少于02428,这在细胞水平上验证了02428-nal11的窄叶、细杆表型。通过扫描电镜观察,发现三叶期02428-nal11叶片上表皮的气孔密度极显著大于02428,下表皮气孔极显著小于02428。成熟期02428-nal11叶片上表皮的气孔密度、大小均显著小于02428,下表皮则仅气孔显著小于02428。此外,无论是幼苗期还是成熟期,02428-nal11叶片上表皮的刺毛均比02428相对发达。(3)通过测定02428与02428-nal11的三叶期幼苗的IAA、GA3、ABA及ZEATIN激素含量,发现02428-nal11的GA3与ABA含量极显著或显著低于02428,而IAA和ZEATIN的含量无显著差异,推测nal11导致的窄叶、细杆、多蘖、稀穗等表型与IAA无显著关系,而极可能与GA3和ABA相关,尤其可能作为ABA代谢调控途径中的某个位置发挥作用。(4)、通过对目的基因NAL11的结构分析,其编码区第二外显子的最后一个碱基处发生G→T的单碱基突变,并接入含有TAA终止密码子的内含子序列,变异剪接导致下游cDNA序列变化出现终止密码子而导致蛋白翻译提前终止。蛋白预测表明NAL11编码形成含Dna J保守结构域的热激蛋白,属于第三类J蛋白。氨基酸序列多重比对和系统进化分析,发现NAL11在多个单子叶物种中高度保守,尤其在野生稻中存在极高的同源性,表明NAL11是保守进化的基因,可能对植物的生长发育起着关键作用。启动子序列分析表明NAL11可能参与了多种激素的代谢调控,尤其是ABA,此外还可能参与其他热激、防卫与应激响应有关的多种生物学过程。(5)、通过表达载体构建与遗传转化研究NAL11的功能,1300遗传互补验证试验验证了NAL11的功能。GUS表达转基因植株的组织化学染色结果表明,NAL11在水稻的根、茎秆、叶片、叶鞘、穗中均有表达,推测与维管组织的发育密切相关。亚细胞定位结果表明NAL11目的蛋白主要定位于叶绿体上,少部分在内质网上。推测其可能参与叶绿体的某些生物反应过程,并且可能作为分子伴侣参与其他新生肽链的折叠、蛋白质的组装和跨膜转运。(6)、通过RT-PCR,验证了ZYX中的SNP导致其mRNA变异剪接与转录翻译的异常,进一步说明NAL11作为目的基因对ZYX的株型各性状调控产生影响。通过real-time荧光定量PCR分析,NAL11在第20d-60d叶片中的表达量较高,在02428中除了第75d,其余7个时期叶片的表达量均显著或极显著高于02428-nal11;NAL11在2-4期幼穗中维持较高的表达水平,在02428中除了第6期,其余6个时期幼穗的表达量均显著或极显著高于02428-nal11;NAL11在孕穗期(约6期)的茎秆、叶鞘和幼穗表达水平较高,在叶片、叶鞘及幼穗中的表达量,02428显著低于02428-nal11。推测NAL11在02428叶片、穗部的表达约在孕穗期幼穗6期短暂出现比02428-nal11较低的表达水平,但这最终并不影响02428与02428-nal11表型上的差异。
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