藏药波棱瓜子是藏医常用的抗乙肝药物,具有良好的治疗效果,其主要活性成分之一波棱甲素（Herpetrione,Her）是一种难溶性木脂素类成分,属于BCSII类,生物利用度低,成药性差。纳米混悬剂（nanosuspension,NS）通常是指纯药物以晶态或无定型形式,在稳定剂的稳定下分散在液体中的亚微米胶体分散体系。若药物以无定型形式分散,也可称为无定型纳米粒（Amorphous nanoparticles,ANPs）。纳米混悬技术已成功用于克服活性药物成分的难溶性问题。课题组前期将Her制备成ANPs,通过体外释放、药动学实验与原料药进行比较,发现其累计释放度和生物利用度显著提高。但Her-ANPs口服后是以分子还是以ANPs整体形式吸收、是如何提高生物利用度的,以及Her-ANPs注射后药物纳米粒的体内行为如何等关键科学问题仍不清楚。本实验利用一种具有遇水聚集淬灭（Aggregation caused quench,ACQ）特性的环境响应型荧光探针,应用荧光杂化技术,将ACQ荧光探针包埋入Her-ANPs中,构建杂化Her-ANPs,考察其体内命运;以阐释Her-ANPs的体内生物学特性,进一步拓展对药物ANPs在体内性能的认识。采用反溶剂沉淀法制备ANPs,通过单因素实验优化,成功制备了两种不同粒径的Her-ANPs,即Her-ANPs-200、Her-ANPs-450。粒径分别为200 nm和450nm;PDI小于0.2。扫描电镜结果显示,Her-ANPs-200、Her-ANPs-450均呈圆球状;DSC和XRD结果显示Her原料药及不同粒径的Her-ANPs均为无定型形态,表明纳米化过程不会影响Her的物理状态。体外验证实验表明,在不同介质中Her-ANPs具有较高的荧光稳定性;水淬灭ACQ探针在Her-ANPs溶解后具有高度灵敏性;Her-ANPs的荧光信号随时间变化的趋势与药物溶解的趋势相关性良好,ACQ探针包载入Her后,其荧光信号的变化可用来指示ANPs的状态变化;准确灵敏地识别ANPs的整体结构,可用于Her-ANPs体内命运的研究。通过小动物活体成像、离体脏器组织成像等方法对口服Her-ANPs后体内的分布、滞留及降解情况进行了研究,研究发现大鼠口服不同粒径的Her-ANPs,其在体内没有迅速地溶出释放,而是能够在胃肠道内留存至少8 h。组织分布结果显示,在给药1 h后可在肝脏中观察到荧光信号,且荧光信号可维持24-36 h,但在肝脏观察到的荧光信号较弱,表明Her-ANPs口服后有少部分能以整体粒子的形式吸收。未能在其他脏器检测到明显的荧光信号,可能是因为整体Her-ANPs的吸收量较少,且释放较快。进一步通过单向肠灌流实验、肠道冷冻切片观察发现,肠腔侧（AP）和基底侧（BL）均可以观察到荧光信号,表明Her-ANPs可以整体形式被肠上皮细胞摄取,且大粒径的Her-ANPs-450更易被回肠整体摄取。将Her药物制备Her-ANPs后,粒径状态高度分散,比表面积大,从而使其在胃肠道的黏附增加,药物的滞留时间延长。综上所述,Her-ANPs是由少量ANPs整体进入体循环,同时延长与胃肠道的接触时间来改善吸收的。建立了Caco-2、Caco-2/HT29-MTX以及Caco-2/HT29-MTX/Raji 3种细胞模型对细胞摄取和跨膜转运进行研究。结果显示,Her-ANPs-200和Her-ANPs-450都可以整体ANPs形式被细胞摄取,但摄取量少,小粒径的Her-ANPs更易在上皮细胞摄取,因为较小的粒径可减少与细胞的粘液网格结构相互作用,更易穿透黏液层。但是在三种细胞的转运实验中,接收池未观察到荧光信号,这有可能是摄取与转运的量较少导致。本研究进一步证明了不同粒径的Her-ANPs口服后均有部分以整体ANPs的形式吸收进入细胞,并受黏液层影响,小粒径的ANPs可通过提高粘液屏障穿透能力来改善口服药物的吸收。通过体外释放、药代动力学及药效学实验,比较Her制成ANPs对释放度、口服生物利用度及药效学的影响,并探讨粒径差异。体外释放度实验结果显示,Her-ANPs-200,Her-ANPs-450与Her原料药相比,Her-ANPs的体外释放度显著提高（P＜0.05）,ANPs粒径与释放度呈负相关,较小的ANPs具有较大的比表面积,导致ANPs的体外释放度提高。药动学结果显示,两种粒径Her-ANPs的药时曲线下面积AUC（0-t）和达峰浓度Cmax均显著高于Her原料药（P＜0.01）;表明制备Her-ANPs可使生物利用度显著提高。这主要是因为Her-ANPs显著降低了原料药的粒径,增加Her的溶出及与胃肠道的黏附性,促进了Her的吸收,进而提高了Her的口服生物利用度。此外,显著延长的MRT（0-t）也有利于生物利用度的增加。Her-ANPs-200的AUC（0-t）和Cmax高于Her-ANPs-450,说明小粒径更有助于生物利用度的改善。药效学结果显示由CCl4诱导的急性肝损伤小鼠,在口服Her和Her-ANPs后,均产生保护作用。Her对小鼠肝损伤的保护作用,由抗氧化酶（SOD、GSH-Px）的增加、脂质过氧化（MDA）和炎症细胞因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）的降低可提示其与增强抗氧化酶活性、减少脂质过氧化产物及减少炎症细胞因子有关。两种粒径的Her-ANPs较原料药Her的治疗效果更为显著,主要是因为Her制备成Her-ANPs后,体内的吸收增加,从而使其药效作用增强。对尾静脉注射两种粒径的Her-ANPs粒子的体内分布降解动力学进行研究,通过小动物活体成像结果显示,Her-ANPs-200/450注射后大鼠全身均可观察到荧光信号,粒子血液动力学表明ANPs经血液循环并在全身分布,且能保持至少36 h;小粒径的Her-ANPs-200更快进入血液循环,而Her-ANPs-450在血液中有较长的驻留时间,药物溶出慢,荧光信号强度降低较缓慢。组织分布动力学研究结果表明,Her-ANPs注射后均可被各脏器摄取并有较长的驻留时间,此外,在肝脏中Her-ANPs-450组的荧光保留时间明显强于Her-ANPs-200组,说明大粒径的Her-ANPs更易在脏器中驻留。通过HPLC来测定生物样品中Her的浓度,药动学研究结果显示,Her-ANPs-200/450在心、肝、脾、肺、肾各组织分布快速而广泛,均有不同浓度的Her被检出。Her-ANPs-200、Her-ANPs-450注射后的各脏器AUC0-t顺序均是:肝＞肺＞脾＞肾＞心,注射Her-ANPs后粒子更易富集于（Reticulo-endothelial system,RES）的器官（肝、脾、肺）。Her-ANPs-450在肝、脾、肺组织中的摄取高于Her-ANPs-200,这是因为RES的吞噬作用而具有被动靶向性,使RES器官摄取Her-ANPs-450的量较多,另外,Her-ANPs-450释放慢,在脏器中易驻留。对口服和注射Her-ANPs粒子的组织分布动力学进行分析比较。以（Total radiant efficiency,TRE）计算的Her-ANPs-200/450口服后绝对生物利用度分别为2.41%、1.75%;以（Average radiant efficiency,ARE）计算的Her-ANPs-200/450口服后绝对生物利用度分别为0.74%、0.66%。进一步结果表明以TRE计算粒子的贡献分别为7.12%（Her-ANPs-200）和7.82%（Her-ANPs-450）,以ARE计算的粒子的贡献分别为2.19%（Her-ANPs-200）和2.95%（Her-ANPs-450）。综上所述,本研究应用ACQ荧光探针杂化木脂素类药物Her,成功验证了其进行ANPs体内命运研究是可行的,口服Her-ANPs-200、Her-ANPs-450后都有部分ANPs以整体形式经小肠上皮细胞途径吸收。同时通过延长与胃肠道的接触时间和提高粘液屏障穿透能力来改善口服药物的吸收。注射Her-ANPs后粒子更易富集于含有网状内皮系统（RES）的器官（肝、脾、肺）,提示其具有一定的RES器官靶向性,因此更有助于RES器官相关疾病靶向治疗。