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动脉硬化、糖尿病血管并发症是导致心、脑血管意外的主要原因。高出非糖尿病人群2--4倍，70％的2型糖尿病患者死于心血管疾病【1】。动脉粥样斑块形成是导致心血管事件最常见的病理改变，但近年对糖尿病血管并发症的研究发现，除动脉粥样斑块形成这一传统的危险因素外，血管钙化亦是导致糖尿病患者心血管事件发生的重要因素。最近研究发现血管钙化类似于骨的形成，它是由细胞介导的主动调节过程，同时存在平滑肌细胞表型转变【4】。血管平滑肌细胞(VSMCs)作为动脉钙化的主要细胞，它的体外诱导钙化成为心血管疾病发病机制的重要研究模型。最近研究发现AGEs在糖尿病血管钙化的发生中可能发挥重要作用【5】。现己证明人血管平滑肌细胞存在AGEs受体(RAGE)。DM患者体内AGEs的代谢增强，致使AGEs增多【6】。AGEs与其受体RAGE相互结合，导致变态反应和氧化应激，是诱发糖尿病血管病变的主要原因之一【7】。糖尿病患者AGEs表达较正常人升高。AGEs通过与受体RAGE结合，改变细胞内信号表达，使内皮细胞功能紊乱，多种因子表达发生变化，从而刺激平滑肌细胞迁移增殖，加快糖尿病动脉粥样硬化进一步演变【9】。AGEs诱导平滑肌细胞向成骨细胞转化，并促进血管钙化的发生。本研究发现AGEs促进人股动脉平滑肌细胞增殖的钙化，AGEs处理平滑肌细胞后其RAGE表达明显增高，并呈浓度梯度依赖，同时OPG的表达和β-catenin在细胞核内聚集增强，研究发现通过上调RAGE,OPG，β-catenin表达水平而促进平滑肌细胞钙化，进一步证实RAGE在糖尿病动脉中膜钙化中的作用。第一部分人股动脉平滑肌细胞的结构目的：建立人股动脉平滑肌体外培养模型方法：运用组织块贴壁法，成功培养出人HSMCs，在倒置显微镜下进行细胞形态学观察并对培养的细胞进行SM a—actin免疫组化鉴定。结果：细胞生长良好，平滑肌细胞呈典型的“峰谷状”生长，经过免疫荧光发现，细胞SMα-actin高表达，说明成功培养出平滑肌细胞。结论：人股动脉组织块贴壁法成功培养出HSMCs，经过免疫荧光发现，细胞SMα-actin高表达，说明成功培养出平滑肌细胞。为后续实验打好基础。第二部分AGEs调控平滑肌细胞钙化的实验研究目的：探讨AGEs促进平滑肌细胞钙化方法：1，检测各实验组细胞内钙离子浓度；2，通过VON KOSSA染色说明AGEs促进HSMCs钙化；3,免疫荧光检测β-catenin的表达；4， western blot检测RAGE, β-catenin,OPG，E-cadherin蛋白的表达情况;5, RAGEsiRNA干预后, western blot检测RAGE, β-catenin, OPG,E-cadherin蛋白的表达情况,并与为干预之前作比较。结果：1.通过观察各组细胞培养形态，钙化+AGES组的钙化斑块明显多于钙化组。2.细胞VON KOSSA染色结果表明随着AGE-BSA浓度的增加，其钙化表达的量逐渐升高，同时钙化加AGEs（20mg/L）组细胞数量明显多于钙化组，细胞质，细胞核呈现粉红色的数量亦增加。3.细胞内钙离子浓度测定结果显示钙化+AGEs20mg/L组的钙离子浓度明显升高，其次AGEs40mg/L组亦升高，这两组P<0.01，有显著统计学差异，而钙化组和AGEs20mg/L细胞内钙离子浓度亦明显升高，P<0.05。4. β-catenin的表达随着AGEs浓度的增加而增强，推断可能由于AGEs的受体RAGE激活了wnt/β-catenin信号通路，同时其下游蛋白OPG的表达亦增强.5. siRNA干扰后, RAGE，β-catenin，OPG的表达降低。结论1.AGEs促进人股动脉平滑肌细胞钙化，并呈浓度梯度。2.随着AGEs干预浓度的增加，RAGE的表达增强，表明AGEs诱导的HSMCs增殖与RAGE表达有关；3. AGEs通过与受体RAGE结合，激活wnt/β-catenin信号通路，促使其下游β-catenin，OPG表达增强，促进平滑肌细胞钙化。