反义寡核苷酸体外抑制人骨肉瘤细胞PCNA表达的实验研究

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研究表明,恶性肿瘤的发生、发展与由于基因表达调控异常、生长因子分泌功能失常、信号传导异常、程序化死亡的衰减等方面密切相关。通过各种机制,肿瘤细胞逃避调亡不仅是其获得永生性,发生和演进的重要原因,而且可导致抗化疗/放疗细胞株的形成。这些因素最终通过DNA的复制、转录和翻译导致肿瘤细胞的异常分化与无限增殖。我们研究与肿瘤细胞增殖和调亡的相关基因的表达及其与恶性肿瘤发生、演进之间的关系,对于进一步明确恶性肿瘤的发病机理、提高治愈率和开辟新的治疗途径有着重要的现实意义。骨肉瘤是除浆细胞骨髓瘤以外骨骼系统最常见的原发性恶性肿瘤,主要见于15~25青少年,男性多于女性。其发病率各国的统计数字差异较大,约1/10万~0.1/10万,在我国尚无关于其发病率和死亡率的精确统计资料。骨肉瘤恶性度高,易早期转移,治疗后易复发,预后较差,危害性大死亡率高。随着辅助化疗、外科手术技术、骨重建方法和改进临床分期方法的发展,越来越多的数患者接受了保肢手术,并有复原的希望。但目前的治疗方法,五年生存率从50-65%不等,仍有许多患者无法从中受益。复发和转移仍然是致命的结果,若发生转移,生存率更低(30%)。目前对骨肉瘤患者的总体治疗效果较差,如何提高骨肉瘤患者的治疗率、探索新的治疗方法始终是临床关注的焦点。反义核酸基因治疗主要依赖于Watson-Crick的核酸碱基配对原理,合成与特异基因互补的、小的单链寡核苷酸导入肿瘤细胞,与相应mRNA杂交,从而在翻译水平阻断某些异常基因的表达。反义核酸治疗技术因其具有高效简便、不需要载体等特点,已成为近年来肿瘤基因治疗的研究热点之一。增殖细胞核抗原(PCNA)是DNA聚合酶δ的辅助因子,是DNA合成必不可少的物质,参与细胞周期调控,与核酸代谢中的多种调节蛋白密切相关。研究表明,PCNA在骨肉瘤中高表达,与恶性程度和预后呈明显的相关性。目前已有以PCNA为反义基因治疗靶点的研究见诸报道,但是PCNA-ASODN作用于人成骨肉瘤细胞MG-63后对PCNA表达的影响尚未见报道。我们以增殖细胞核抗原为靶基因,应用脂质体介导PCNA-ASODN转染人骨肉瘤细胞MG-63 ,并观察其对MG-63细胞PCNA mRNA、蛋白表达及细胞增殖活性的影响。目的本试验主要是探讨PCNA-ASODN抑制人骨肉瘤细胞MG-63细胞株PCNA表达的效果。方法应用脂质体介导的PCNA反义寡核苷酸转染人骨肉瘤细胞MG-63,RT-PCR、Western blot法检测转染后PCNA mRNA及蛋白的表达,MTT比色法和集落形成试验检测细胞的增殖活性。结果ASODN组细胞的集落形成率显著低于空白组(p<0.01);ASODN能显著抑制PCNA mRNA、蛋白的表达,ASODN组24h后mRNA的表达为空白组的31.36%;蛋白表达为空白组的40.00%,细胞增殖抑制率为65.64%;结论PCNA-ASODN可显著抑制PCNA mRNA及蛋白的表达,抑制MG63细胞的增殖。
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