[目的]研究藤黄酸增加放射线对人食管癌TE13细胞株的敏感性,并探讨其可能的机制,为藤黄酸作为放射增敏剂应用于临床提供理论依据。[方法](1)CCK-8测定藤黄酸对TE13细胞的生长抑制作用,并通过该实验确定藤黄酸最佳工作浓度;(2)克隆形成实验检测藤黄酸的放射增敏作用,在镜下计数含有50个及以上细胞的集落数;(3)蛋白印迹法检测不同处理组中LC3、caspase-3、caspase-8、caspase-9、p-Akt、p-mTOR 等蛋白的表达水平;(4)流式细胞仪检测不同处理对细胞凋亡率的影响;(5)免疫荧光实验检测不同处理组中细胞内LC3的产生及分布;(6)使用Ad-mRFP-GFP-LC3感染TE13细胞,mRFP用于标记及追踪LC3,GFP的减弱可指示自噬溶酶体的出现。两种荧光通道图像融合后出现的黄色斑点即是自噬体,红色的斑点指示自噬溶酶体。从而检测自噬流的强弱;(7)采用DCFH-DA探针检测细胞内活性自由基产生的强度,激光扫描共聚焦显微镜下观察并记录结果。[结果](1)CCK-8实验结果示藤黄酸抑制人食管癌TE13细胞增殖,且存在浓度和时间依赖性。藤黄酸处理24h和48h,半数致死剂量IC50分别为1.47μmol/L和1.14μmol/L;(2)藤黄酸增敏浓度、作用时间及照射剂量的选择:我们选取药物处理24h时细胞存活率与对照组无差异的0.25或1 μgmol/L作为后续实验的工作浓度,时间点则定为处理后24h。预实验中,藤黄酸联合不同放射剂量处理细胞,免疫印迹结果示射线剂量为6Gy的联合作用组自噬产生最强,选用该剂量作为后续实验的照射剂量;(3)藤黄酸增加TE13细胞对放射线的敏感性:0.25μmol/L 或1μmol/L藤黄酸处理TE13细胞24h,克隆形成率较单纯照射组显著减少,SERD分别为1.217和1.436;(4)藤黄酸联合放射线处理组的细胞凋亡率较单纯照射组明显增加;(5)藤黄酸促进自噬的产生但损害自噬流:免疫荧光实验示,藤黄酸单独作用组可引起LC3-Ⅱ的表达增高;较单纯照射组,联合作用组中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加。Ad-mRFP-GFP-LC3感染细胞的实验结果示,在自噬体的数量方面,藤黄酸单独作用组较空白组显著增加,联合作用组较单纯照射组显著增加,但是自噬溶酶体数量均不存在上述变化;(6)藤黄酸导致细胞活性氧负荷加重,并可能通过活性氧簇介导的Akt/mTOR通路发挥放射增敏作用。激光共聚焦测量细胞内活性氧簇产生情况显示,藤黄酸可导致活性氧自由基的累积和Akt/mTOR通路的抑制。加入活性氧抑制剂后,无论是LC3-Ⅱ、凋亡相关蛋白表达量、细胞凋亡率还是自噬的产生均显著降低,p-Akt、p-mTOR的表达水平则上调。[结论]藤黄酸可能通过增加活性氧含量和抑制Akt/mTOR通路来调节肿瘤细胞的凋亡和自噬活动,从而产生放射增敏的效果。