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CRISPR系统是原核生物的一种获得性免疫系统,近年来随着CRISPR/Cas9研究的不断发展,其基因编辑功能逐渐被应用于各个生物学领域。利用CRISPR/Cas9系统对靶标序列的识别,辅助病毒基因的敲除和重组,可提高新毒株的获得效率。疱疹病毒的基因组为线性双链DNA分子,其中伪狂犬病病毒（PRV）和牛疱疹病毒（BHV）的基因组皆能通过sgRNA引导,而被CRISPR/Cas9系统所编辑,可作为其他病毒基因敲除和重组的模式参考。本研究通过构建含敲除目的基因左右同源臂的重组质粒,当目的基因被Cas9蛋白切开后,利用同源重组原理将目的基因替换为eGFP荧光标记蛋白,从而达到基因敲除的目的,并将纯化得到重组的疱疹病毒进行生物学特性分析,建立了高效构建疱疹病毒重组毒株的技术平台。本论文的主要研究结果如下:1.构建PRV TK-/eGFP+毒株利用聚合酶链式反应（PCR）从PRV Bartha-K61株基因组DNA中扩增含TK启动子的TK基因同源臂左臂和TK基因同源臂右臂,与eGFP基因序列一起,顺序克隆至克隆载体pUC19中,构建重组载体pUC19-TKLR-eGFP;同时,设计针对TK基因的sgRNA,构建pX335-sgRNA-TK载体,测序验证后,与PRV Bartha-K61株基因组DNA共同转染BHK-21细胞。出现重组病毒的绿色荧光病变后,利用蚀斑纯化技术,获得PRV Bartha-K61 TK-/eGFP+重组毒株。通过TCID50检测病毒滴度,绘制重组毒株的生长曲线,证明其生长特性无差异性改变。通过小鼠攻毒实验,对比小鼠体重变化和死亡情况,发现TK基因敲除后,病毒致病性降低。2.构建BHV-1 gIgE-/eGFP+毒株利用聚合酶链式反应（PCR）从BHV-1 Bartha株基因组DNA中扩增gI和gE两个基因的左右同源臂,将CMV启动子的eGFP基因表达盒插入同源臂中,之后利用同源重组酶将线性化的pUC19载体与之连接成环,构建重组载体pUC19-gIgELR-eGFP;设计针对gI和gE基因的sgRNA,构建plenti-sgRNA-gIgE载体。将以上质粒转染293T细胞,同时接种BHV-1 Bartha Nu/67病毒,利用293T细胞作为媒介,使BHV株发生基因重组,之后将293T细胞转接MDBK细胞,使重组毒增殖并保持感染性。待出现绿色荧光的病变后,蚀斑纯化得到BHV gIgE-/eGFP+重组毒株。测定重组毒株的生长曲线,证明其生长特性无差异性改变。将重组毒接种小鼠后,用阻断ELISA测定小鼠血清抗体水平,gB抗体呈阳性表明重组毒株保持免疫原性,gE抗体呈阴性表明gE基因被敲除。