研究背景肿瘤的转移和复发是其恶性表现最基本的特征,同时这也是影响患者预后最主要的因素。近年来,肺癌的发病率逐年提高,现已经成为最为高发的肿瘤之一,其也位居肿瘤相关性致死率方面的首位。目前,对于早期的肺癌患者来说,根治性手术切除仍然是首选的治疗方式。尽早发现尽早治疗,可以明显提高患者的预后水平和生活质量。然而,大多数患者在诊断疾病时已处于中晚期,治疗方式主要以放化疗手段为主。即便有些患者术后诊断为早期肺癌,但部分仍有可能出现复发和转移。当前,由于肺癌早期阶段的发生发展较为隐匿,同时缺乏特异性的筛查指标和预防措施,有些患者即便接受手术或者放化疗,其预后仍然不理想。因此,了解肺癌的发生发展机制并进一步探索其生物学特性从而显得至关重要。B型排斥性导向分子(Repulsive guidance molecules B,RGMB)是排斥性导向分子(RGMs)家族的成员之一。先前已有研究表明在乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌中,RGMB的表达异常与肿瘤的发生发展具有一定的相关性。但在肺癌中仍少见相关报道。另外,RGMB作为骨形态发生蛋白质(Bone Morphogenetic Proteins,BMPs)的共表达受体,其是否会参与并调控BMPs信号通路仍然未知。前期有研究显示,RGMs可改变肿瘤细胞的恶性生物学行为,抑制其侵袭转移的能力。本研究的目的旨在研究RGMB在肺癌中的表达情况和其相关的生物学行为。研究目的本课题首先通过搜索TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库搜集肺癌组织中RGMB的表达情况,利用统计学方法分析表达的相关性。进一步通过RT-PCR(real-time polymerase chain reaction)检测了我院120例肺癌组织和30例正常肺组织中RGMB基因的表达情况,分析RGMB基因表达水平与患者临床指标及疾病预后的相关性。同时,检测对不同肺癌细胞株进行RGMB基因表达水平的检测,筛选出高表达的细胞株并构建稳定的RGMB基因敲除细胞模型,为下一步验证其对肿瘤细胞功能的影响和通路研究做进一步准备。研究方法1.对TCGA数据库进行分析,研究RGMB表达情况与肺癌的相关性。2.对临床正常肺组织和肺癌组织标本中RGMB基因的表达量应用荧光定量PCR方法检测,前瞻性分析RGMB表达水平与临床病理、分期及预后的关系。3.对高表达RGMB基因的肺癌细胞株进行筛选,使用荧光定量PCR对多种肺癌细胞株进行RGMB mRNA的检测,从而进一步筛选出RGMB基因处于高表达的肺癌细胞株,为后续的实验作进一步准备。4.pLVX-shRNA-Puro-RGMB真核表达载体的构建及其鉴定利用国际上公认的引物设计网站设计及筛选相关序列,交由生物公司进行合成。将所设计的引物与pLVX-Puro质粒重组之后,同时制备感受态的大肠杆菌,对其进行转染,对其结果进行阳性克隆的鉴定,并提取质粒;再利用脂质体转染293T细胞株,对其转染干扰效率应用荧光定量PCR检测进行检测,将高干扰效率片段筛选出后并进行慢病毒包装和后续实验。5.慢病毒LV-RGMB-scramble和LV-RGMB-shRNA的制备,感染A549细胞株在293T细胞中进行慢病毒的包装、收集及滴度测定,进一步使用该病毒感染筛选出的高表达RGMB的肺癌细胞株A549,利用嘌呤霉素进行稳定筛选和培养,从而获得RGMB基因稳定敲除的肺癌细胞株,转染效率利用mRNA的测定进行判定,分别从蛋白及基因及水平利用western blot法和荧光定量PCR对转染细胞株中RGMB的表达情况进行检测。6.沉默RGMB基因对肺癌A549细胞功能的影响利用MTT实验(methyl thiazolyl tetrazolium test)根据细胞存活率来描述细胞的生长情况;利用细胞粘附实验观察其黏附能力;对细胞的迁移及侵袭能力的测定则利用划痕实验、细胞迁移实验及Transwell侵袭实验进行观察。7、利用Western blot对RGMB表达降低的细胞株中BMPs信号通路蛋白分子表达的检测。结果1.通过TCGA数据库中肺癌RGMB表达情况的分析得出,RGMB基因在肿瘤组织中下调,并且与T和N分期具有显著的负相关性。在男性患者中表达较低。2.进一步对我院肺癌标本进行研究,对RGMB的基因表达水平应用RT-PCR进行检测,结果发现,与正常肺组织相比,肺癌组织中RGMB基因表达水平显著降低(P<0.05)。同时,发现女性患者含有的RGMB表达水平相对较高。肺癌晚期人群RGMB表达水平较低,而早期人群RGMB水平高表达(P<0.05)。结果提示RGMB高表达与较好的临床预后和生存状态相关。3.我们成功筛选出了肺癌细胞株A549为高表达RGMB基因的细胞株。并成功构建针对RGMB基因的RNAi真核质粒,经酶切鉴定,将所得的质粒转染293T细胞后,RT-PCR结果提示该质粒可以产生理想的干扰效果。4、我们成功包装了慢病毒LV-RGMB-scramble、LV-RGMB-shRNA,进一步将其感染A549肺癌细胞株,经嘌呤霉素进行筛选后,结果提示实验组A549细胞RGMB的mRNA的表达比未处理细胞下降约65%(p<0.05)。表明已成功构建RGMB基因稳定敲除的肺癌细胞株。5、A549 RGMB基因稳定沉默肺癌细胞株体外增殖能力、黏附、迁移和侵袭能力与对照组相比明显增强(P<0.05)。6、为了研究RGMB是否参与BMP的信号通路,我们利用RGMB稳定沉默和对照组A549细胞株进行研究。用Western blot检测BMPs信号通路中蛋白分子,发现RGMB沉默后Smad-1/5/8磷酸化水平上升(p<0.05);然而ERK和JNK蛋白的活化水平两组间未见明显改变。该结果认为RGMB可能是通过抑制Smad1/5/8通路来发挥抑制肿瘤的作用。结论1、成功构建了针对RGMB基因的慢病毒干扰载体,对肺癌细胞A549中RGMB基因的表达状态可持续稳定的发挥抑制作用。2、沉默RGMB基因的表达能够促进肺癌细胞的生长、侵袭和转移等细胞功能。3、RGMB可能是通过抑制Smad1/5/8通路来发挥抑制肿瘤的作用。