荞麦属于蓼科(Polygonaceae)荞麦属(Fagopyrum)植物,是一种联合国粮农组织公认的药食同源作物。我国是荞麦的发源国和主产国,种质资源丰富、栽培历史悠久、分布地域辽阔。荞麦不仅具有很高的营养价值而且具有优秀的药用保健功效,这点在我国历代古医书中多有记载。现代医学研究亦表明荞麦及其提取物具有广泛的药理活性,包括抗氧化、抗炎、防癌抗癌、降血糖、降血脂和降血压等,食用荞麦可以有效降低乳腺癌、结直肠癌、糖尿病、高血压、高血脂等常见疾病的发病率以及改善其症状。现代社会随着食疗观念的日益盛行,荞麦的价值逐渐得到人们的重视,除了被用来加工成各种风味食品外,还被用于生产一系列的绿色功能性保健品。外源毒性化合物可以通过多种途径进入人体,攻击细胞中的生物功能蛋白和DNA,进而导致各种疾病甚至是恶性肿瘤的发生,严重危害人类健康。人体在长期进化过程中逐渐形成了一套复杂的外源毒物代谢消除系统,主要涉及两大酶家族,即一相酶和二相酶。然而研究报道一相酶催化下的一相反应常常涉及某些前致癌物或间接致突变物的激活;而二相酶(如QR、GSTs和UGTs)催化下的二相结合反应能有效清除多种致癌、致突变化合物及其它毒性亲电子体和活性氧簇,发挥真正的解毒和抗氧化功效,从而维护机体内环境的稳定。因此诱导二相酶的表达是机体对抗外源毒物的主要保护机制,同时也被认为是实现癌症化学预防的重要策略。然而目前对于荞麦具有癌症化学预防活性及其化学决定子的调查研究相对较少,尤其是关于荞麦及其化合物通过诱导二相酶活性而发挥癌症化学预防作用的研究尚未见报道。因此,本文利用小鼠肝癌Hepa 1c1c7细胞系,以典型的二相解毒酶—醌还原酶(QR)作为生物标记目标酶,持续检测荞麦不同极性提取物及其每一步次级馏分的QR诱导潜力,从而活性追踪、分离鉴定荞麦中的QR诱导化合物;并测定分离所得化合物单独作用以及两两混合作用时的QR诱导活性,以评估荞麦化合物单用时的QR诱导潜力以及联用时化合物之间的相互作用情况,旨在实现荞麦中具有QR诱导活性的化合物的系统性分离鉴定及相应活性研究。全文主要研究内容及成果总结如下:1.对荞麦弱极性提取物中的QR诱导化合物进行了分离纯化和结构鉴定。以正己烷和乙酸乙酯连续提取荞麦面粉得到正己烷提取物和乙酸乙酯提取物,组成荞麦弱极性提取物。接着在正己烷-80%甲醇溶液萃取粗分的基础上,以QR诱导细胞试验为活性追踪导向,利用正相硅胶柱色谱、TLC、制备薄层色谱等分离纯化技术从80%甲醇相萃取产物中分离得到了3个化合物,经核磁共振和质谱等现代波谱方法分析检测以及与文献报道对比理化性质后鉴定为阿魏酸乙酯(1)、2,5-二甲基-4-羟基-3(2H)-呋喃酮(2)和原儿茶酸(3)。2.对荞麦甲醇提取物中的QR诱导化合物进行了分离纯化和结构鉴定。荞麦面粉甲醇提取物经乙酸乙酯、正丁醇和水液液连续萃取粗分后,以体外QR诱导细胞试验为活性追踪导向,运用硅胶柱层析(正相及C18反相)、制备薄层色谱、葡聚糖Sephadex LH-20凝胶色谱等分离纯化手段从乙酸乙酯萃取物中分离得到了4个化合物,通过NMR和HR-ESI-MS等波谱手段以及结合文献报道对照理化参数后鉴定为N-反式-阿魏酰酪胺(4)、丁香酸(5)、槲皮素(6)和杨梅素(7)。3.采用小鼠肝癌Hepa 1c1c7细胞系调查研究了荞麦化合物单独作用时的QR诱导潜力。结果表明7个化合物均表现出QR诱导作用且均呈现剂量依赖性关系。荞麦化合物的诱导潜力由强到弱依次为阿魏酸乙酯(CD=2.5μM,IC50=80μM)>槲皮素(CD=3.0μM,IC50=32μM)>N-反式-阿魏酰酪胺(CD=23.8μM,IC50>200μM)>杨梅素(CD=57.5μM,IC50=74μM)>2,5-二甲基-4-羟基-3(2H)-呋喃酮(CD=206μM,IC50=283μM)>原儿茶酸(CD=2.0 m M,IC50=2.1 m M)>丁香酸(CD=5.4 m M,IC50=9.3 m M),并且它们在测试剂量范围内的最大诱导倍数依次为6.5、4.2、4.2、3.5、5.3、2.9、3.9。4.通过QR诱导细胞试验检测荞麦化合物两两混合作用时的QR诱导活性,并采用Chou-Talalay联合指数法计算IF值来鉴别化合物之间的相互作用关系。7个化合物共组成了12对混合物,结果表明荞麦化合物两两联用时在QR诱导方面存在拮抗作用或加和作用,具体可归纳为3种情况:①联用化合物在测试剂量范围内表现为拮抗作用,IF>1。符合该种情况的样品共4组,包括阿魏酸乙酯和2,5-二甲基-4-羟基-3(2H)-呋喃酮(1,摩尔浓度比为1.00:5.85)、阿魏酸乙酯和槲皮素(4,摩尔浓度比为1:1)、阿魏酸乙酯和杨梅素(5,摩尔浓度比为1:2)以及槲皮素和杨梅素(12,摩尔浓度比为1:2)。②联用化合物在测试剂量范围内表现为混合效应,小剂量时为拮抗作用,IF>1;大剂量时为加和作用,IF=1。符合该种情况的样品仅1组,为阿魏酸乙酯和N-反式-阿魏酰酪胺(3,摩尔浓度比为1:2)。③联用化合物在测试剂量范围内表现为混合效应,但小剂量时为加和作用,IF=1;大剂量时为拮抗作用,IF>1。符合该种情况的样品共7组,包括阿魏酸乙酯和原儿茶酸(2,摩尔浓度比为1.00:48.66)、2,5-二甲基-4-羟基-3(2H)-呋喃酮和原儿茶酸(6,摩尔浓度比为1.00:8.31)、N-反式-阿魏酰酪胺和丁香酸(7,摩尔浓度比为1.00:25.23)、N-反式-阿魏酰酪胺和槲皮素(8,摩尔浓度比为2:1)、N-反式-阿魏酰酪胺和杨梅素(9,摩尔浓度比为1:1)、槲皮素和丁香酸(10,摩尔浓度比为1.00:50.46)以及杨梅素和丁香酸(11,摩尔浓度比为1.00:25.23)。本文以基于培养小鼠肝癌Hepa 1c1c7细胞的体外QR诱导试验为活性追踪导向,首次对荞麦不同极性提取物中具有QR诱导活性的化合物进行了系统性地分离鉴定和活性研究。在实验所得的7个活性化合物中,QR诱导潜力最强的阿魏酸乙酯为首次从荞麦中分离得到;2,5-二甲基-4-羟基-3(2H)-呋喃酮的QR诱导活性为首次报道;而且由这7个化合物所组成的12个联用组合中化合物之间的QR诱导相互作用关系亦为首次报道。本文的研究结果拓宽了人们对荞麦含有的生物活性成分的认知,为荞麦的癌症化学预防作用指引了方向,为进一步合理利用和综合开发这一药食两用植物资源提供了理论依据。