在骨髓造血组织中，存在造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSCs)，及与造血干细胞的增殖和分化相适宜的环境，即造血微环境。造血微环境包括造血组织中的基质细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)和各种造血因子。骨髓细胞在不同的诱导条件下，具有向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、神经细胞及支持造血的基质细胞等分化的能力。 目的：探讨大鼠全骨髓细胞体外培养的分化规律和分化形态。确定免疫胶体金标记骨髓细胞的方法和条件。方法：采用大鼠全骨髓细胞接种，冰蒸水裂解红细胞，应用本实验室的神经干细胞培养基进行有血清条件下培养，未加其它干预因素即诱导出神经干细胞，进一步分化为神经元和神经胶质细胞。采用光镜、扫描电镜对由骨髓发育成神经细胞的不同阶段进行观察，免疫电镜以直径为15nm的免疫胶体金包埋后标记，从超微结构上对分化的细胞定位、定性。以及用免疫细胞化学和荧光激活细胞计数仪(FACS)检测骨髓细胞在不同分化阶段对神经细胞特异标记物——神经巢蛋白(nestin)和神经核蛋白(neuronal nuclei,NeuN)的表达，观察其演变趋势。结果：①骨髓细胞演变形态观察(光镜)全骨髓细胞从成鼠股骨中分离获得接种后5h见各种形态的细胞，其中较易分辨的有两大类，其一是红细胞，呈圆盘状；另一类是数量较多胞体较大、圆的细胞，半悬浮于培养液中。5d后又见两大类细胞，量少而大的细胞球和形态相对均一的大圆细胞；此外，背景是一些细胞碎片。大细胞球由许多小细胞组成，免疫细胞化学鉴定与周围的大圆细胞同性，表达nestin。10d可见更大克隆球形态，主要见大圆细胞组成，背景一些形态各异杂细胞。换液，复加5％胎牛血清，2d后细胞出现分化，呈出芽状。培养15～20d，胞体呈长梭形，有两个或多个突起，并有突起相互连接。细胞培养30d呈典型神经元样。②扫描电镜观察追踪骨髓细胞分化成神经元样细胞之不同阶段细胞的分化，可确定神经元样细胞的前体在骨髓阶段是一类“大圆细胞”，直径7.5~13.1 pm(9.7士2.1 pm)o24小时左右开始贴壁，前体细胞长出“足”样结构与细胞外基质相连接。约第5天始增殖，呈对称性分裂，并形成克隆团或球，细胞之间的连接呈“线性”。到第12天左右前体细胞呈“出芽”样改变，胞体增大。培养25一30d细胞分化为神经元样。神经元样细胞的形态多样，都有突起(neurite)，包括形似树突(dendrite)和轴突(axon)的两种结构。神经元样细胞胞体的形态有球形、锥形、星形或梭形等，直径在巧.3一36.5，m之间。在突起表面可见许多棘状的小突起，形似树突棘(dendritic sPine)。理论上树突棘是神经元之间形成突触的主要部位，树突棘的数量及分布因不同的神经元而异。与脑源性的神经元一样，神经元样细胞的轴突直径均一，分枝较少。轴突长短不一，在此培养孔里，短的仅数微米，长的可达109.5，m，有侧枝呈直角分出，轴末端的分枝较多，形成轴突终末。轴突常自胞体发出，但也有从主树突千的基部发出。胞体发出轴突的部位亦有呈圆锥形的轴丘(axon hinock)样结构。③免疫电镜、免疫细胞化学和FACS检测细胞培养5d时nestin和NeuN抗体呈弱阳性，逐渐增强，培养第15d的细胞呈典型nestin强阳性反应，而NeuN强阳性反应在25一30d达到高峰，发育成为神经元样细胞。FACS同步检测显示，nestin和NeuN在培养第sd时即有表达，前者3.4%，后者2.5%。随着骨髓细胞的分化，在15d时nestin阳性细胞为22.7%，达到高峰，随后下降;NeuN于30d达到高峰为41 .8%，而此时nestin阳性细胞为5.9%。免疫细胞化学鉴定出神经干细胞、神经元和胶质细胞。通过免疫胶体金技术，在超微结构水平鉴定出神经干细胞和神经元。标记骨髓源细胞的免疫胶体金最适浓度与直径分别为1:50(2 p g/ml)和巧nm。结论:本实验在方法学上具有:①方法简捷;②假定神经细胞是来源于BMSCs，那么全骨髓接种将保留了全部的BMSCs，提高了种子细胞来源量。从超微结构上和免疫细胞化学标记上佐证了骨髓源性神经干细胞的存在，探知了骨髓细胞诱导分化为神经细胞的发育规律，并初步确定了免疫胶体金标记骨髓源细胞的最适浓度与直径，为进一步进行骨髓源性神经干细胞移植应用奠定了基础。